Afgangsprojekt - Diplomingeniør i Kemiteknik [999 KB] - sotoft.dk
Afgangsprojekt - Diplomingeniør i Kemiteknik [999 KB] - sotoft.dk Afgangsprojekt - Diplomingeniør i Kemiteknik [999 KB] - sotoft.dk
K-PROJEKT 7 13081 - Johnny Søtoft Jespersen 12894 - Susan Renneberg Larsen Opformering af Saccharomyces cerevisiae Propagation of Saccharomyces cerevisiae Afleveret d. 11. december 2003 Vejleder: Lene Pedersen Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum Sektor for industri og byggeri Kemiingeniøruddannelserne K-PROJEKT efterår 2003
- Page 2 and 3: K-PRO 7 Synopsis - Dansk Gruppe 2 S
- Page 4 and 5: K-PRO 7 Forord Gruppe 2 Forord Dett
- Page 6 and 7: K-PRO 7 Indholdsfortegnelse Gruppe
- Page 8 and 9: K-PRO 7 Problemformulering Gruppe 2
- Page 10 and 11: K-PRO 7 Insulin Gruppe 2 2 Insulin
- Page 12 and 13: K-PRO 7 Insulin Gruppe 2 Figur 2.3:
- Page 14 and 15: K-PRO 7 Insulin Gruppe 2 Fermenteri
- Page 16 and 17: K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces cee
- Page 18 and 19: K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces cee
- Page 20 and 21: K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces cee
- Page 22 and 23: K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces cee
- Page 24 and 25: K-PRO 7 Fermenteringsteori Gruppe 2
- Page 26 and 27: K-PRO 7 Betydningen af ilt og omrø
- Page 28 and 29: K-PRO 7 Betydningen af ilt og omrø
- Page 30 and 31: K-PRO 7 Betydningen af ilt og omrø
- Page 32 and 33: K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe
- Page 34 and 35: K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe
- Page 36 and 37: K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe
- Page 38 and 39: K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe
- Page 40 and 41: K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2 7
- Page 42 and 43: K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2 5
- Page 44 and 45: K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2 H
- Page 46 and 47: K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2 7
- Page 48 and 49: K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2 7
- Page 50 and 51: K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2 C
K-PROJEKT 7<br />
13081 - Johnny Søtoft Jespersen<br />
12894 - Susan Renneberg Larsen<br />
Opformering af<br />
Saccharomyces cerevisiae<br />
Propagation of Saccharomyces cerevisiae<br />
Afleveret d. 11. december 2003<br />
Vejleder: Lene Pedersen<br />
Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum<br />
Sektor for industri og byggeri<br />
Kemiingeniøruddannelserne<br />
K-PROJEKT efterår 2003
K-PRO 7 Synopsis - Dansk Gruppe 2<br />
Synopsis - Dansk<br />
I dette projekt vil der blive fokuseres på at tilpasse forskellige parametre til opformering af<br />
gæren Saccharomyces cerevisiae, således at der opnås et cellemasseudbytte tæt på den<br />
teoretiske værdi.<br />
Dette gøres ved foretage fermenteringer vha. Saccharomyces cerevisiae. Under disse<br />
fermenteringer udtages prøver, som anvendes til at bestemme cellemasseudbyttet samt til at<br />
finde koncentrationen af uomsat sukker og dannet ethanol i fermenteringsvæsken. Herudover<br />
bestemmes indholdet af nitrogen og kuldioxid i udgangsgassen.<br />
g cellemasse dannet<br />
Der blev opnået en udbyttekonstant på 0,45 , som ligger meget tæt på den<br />
g sukker forbrugt<br />
g cellemasse dannet<br />
teoretiske værdi, der ligger mellem 0,46 og 0,47 .<br />
g sukker forbrugt<br />
Herudover blev der fundet følgende anvendelige fermenteringsparametre; en<br />
omrørerhastighed på 700 O<br />
min , et overtryk på 0,2 bar samt en sukkerkoncentration i<br />
startsubstrat på 7,25 g<br />
L .<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae
K-PRO 7 Synopsis - English Gruppe 2<br />
Synopsis - English<br />
The focus in this project will be to adjust different parameters to the propagation of the yeast<br />
Saccharomyces cerevisiae that makes it possible to achieve a yield of biomass close to the<br />
theoretical value. This will be done by fermentation of Saccharomyces cerevisiae.<br />
Samples were taken during the fermentations, and used for determination of the yield of<br />
biomass and the concentrations of unconsumed sugar and formed ethanol in the fermentation<br />
broth. In addition to this the content of nitrogen and carbon dioxide in the exhaust gas was<br />
found.<br />
A yield coefficient of 0.45<br />
g biomass formed<br />
g sugar consumed<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae<br />
was found. This value is very close to the theoretical<br />
value between 0.46 and 0.47 gbiomassformed<br />
g sugar consumed .<br />
The following usable parameters for fermentation were found; a stirring rate of 700 rpm, a<br />
pressure of 0.2bar above the atmosphere and a sugar concentration of 7.25 g<br />
L .
K-PRO 7 Forord Gruppe 2<br />
Forord<br />
Dette projekt er skrevet som afgangsprojekt for kemiingeniøruddannelserne, Sektor for<br />
Industri og Byggeri på Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum og betragtes som fortroligt.<br />
Projektet omhandler opformering af gæren Saccharomyces cerevisiae. Analyser foretaget<br />
til måling og kontrol af væksten er udført online vha. en PC, samt offline vha. bl.a.<br />
gaschromatograf og et spektrofotometer. Der er i dette projekt blevet ændret på forskellige<br />
parameter for at forbedre væksten af Saccharomyces cerevisiae.<br />
Projektet er en videreførelse af projektet ”Optimering af fed-batchfermentering af<br />
genmodificeret Saccharomyces cerevisiae” udført i foråret 2003 på Ingeniørhøjskolen Odense<br />
Teknikum af A. S. Forssling og J. Johansen. Når der diskuteres og viderearbejdes på data eller<br />
elementer fra dette projekt, henvises med: Forssling et al. Der henvises til kilder med [X],<br />
disse forefindes i litteraturlisten. Yderligere henvises til måledata fra opformeringsforsøgene<br />
med Måledata X, disse forefindes som et ekstra kompendium.<br />
Til sidst skal der rettes en stor tak til Novo Nordisk A/S, specielt Berit Eskerod Madsen og<br />
Michael Elleskov, som har været behjælpelige med gærceller, vitaminer og substratopskrift<br />
anvendt under dette projekt, samt information omkring insulin og fermentering.<br />
Odense, den __________________<br />
Johnny S. Jespersen Susan R. Larsen<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae
K-PRO 7 Indholdsfortegnelse Gruppe 2<br />
Indholdsfortegnelse<br />
1 Problemformulering.....................................................................................................1<br />
1.1 Projektoplæg...............................................................................................................1<br />
1.2 Projektanalyse.............................................................................................................1<br />
1.3 Projektformulering .....................................................................................................2<br />
1.4 Projektafgrænsning.....................................................................................................2<br />
2 Insulin ............................................................................................................................3<br />
2.1 Human insulin ............................................................................................................3<br />
2.2 Industriel produktion af insulin ..................................................................................5<br />
3 Vækst af Saccharomyces cerevisiae .............................................................................8<br />
3.1 Saccharomyces cerevisiae..........................................................................................8<br />
3.2 Metabolisme for S. cerevisiae ....................................................................................9<br />
3.2.1 Udbyttekonstanter...............................................................................................9<br />
3.2.2 Metabolismeligninger.......................................................................................11<br />
3.2.3 Respirationskoefficient.....................................................................................12<br />
3.3 Pasteur-effekt............................................................................................................13<br />
3.4 Crabtree-effekt..........................................................................................................13<br />
3.5 Substratinhibering.....................................................................................................14<br />
4 Fermenteringsteori.....................................................................................................16<br />
4.1 Batch fermentering ...................................................................................................16<br />
4.2 Fed-batch fermentering.............................................................................................16<br />
4.3 Kontinuert fermentering ...........................................................................................17<br />
4.4 Vækstfaser for gærceller...........................................................................................17<br />
5 Betydningen af ilt og omrøring .................................................................................19<br />
5.1 Ilts opløselighed i væske ..........................................................................................19<br />
5.2 Iltoverførsel ..............................................................................................................20<br />
5.2.1 Sammenligning af estimeret KLa og praktisk KLa............................................21<br />
5.2.2 Sammenligning af forskellige P/V forhold.......................................................22<br />
6 Forsøgsbeskrivelse......................................................................................................24<br />
6.1 Forkultur ...................................................................................................................24<br />
6.2 Podning af fermentor................................................................................................24<br />
6.3 Fermentering.............................................................................................................24<br />
6.4 Online dataopsamling...............................................................................................25<br />
6.5 Prøveudtagning.........................................................................................................27<br />
6.5.1 Tørstofbestemmelse..........................................................................................27<br />
6.5.2 Sukker- og ethanolbestemmelse .......................................................................28<br />
6.5.3 Gasanalyse........................................................................................................29<br />
6.5.4 Pladeudspredning .............................................................................................29<br />
6.6 Tilledning til fermentoren.........................................................................................30<br />
6.6.1 Substratforbrug .................................................................................................31<br />
6.6.2 Skumdæmpning................................................................................................31<br />
6.6.3 pH .....................................................................................................................31<br />
6.7 Temperatur................................................................................................................31<br />
6.8 Ilt...............................................................................................................................32<br />
6.9 Autoklavering ...........................................................................................................32<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae
K-PRO 7 Indholdsfortegnelse Gruppe 2<br />
7 Fermenteringerne .......................................................................................................33<br />
7.1 Fermentering 1..........................................................................................................34<br />
7.1.1 Startbetingelser f1.............................................................................................34<br />
7.1.2 pH og temperatur f1..........................................................................................34<br />
7.1.3 Ilt f1 ..................................................................................................................35<br />
7.1.4 Værdier fra Forssling et al................................................................................36<br />
7.1.5 Sukkerkoncentration f1.....................................................................................37<br />
7.1.6 Ethanolkoncentration f1 ...................................................................................38<br />
7.1.7 Deldiskussion 1 ................................................................................................38<br />
7.2 Fermentering 2..........................................................................................................38<br />
7.2.1 Startbetingelser f2.............................................................................................38<br />
7.2.2 pH og temperatur f2..........................................................................................38<br />
7.2.3 Substrattilledning f2 .........................................................................................39<br />
7.2.4 Sukker- og ethanolkoncentration f2 .................................................................39<br />
7.2.5 Ilt f2 ..................................................................................................................40<br />
7.2.6 Deldiskussion 2 ................................................................................................41<br />
7.3 Fermentering 3..........................................................................................................41<br />
7.3.1 Startbetingelser f3.............................................................................................41<br />
7.3.2 Temperatur f3 ...................................................................................................41<br />
7.3.3 Ilt f3 ..................................................................................................................42<br />
7.3.4 Deldiskussion 3 ................................................................................................42<br />
7.4 Fermentering 4..........................................................................................................43<br />
7.4.1 Startbetingelser f4.............................................................................................43<br />
7.4.2 pH og temperatur f4..........................................................................................43<br />
7.4.3 Ilt f4 ..................................................................................................................44<br />
7.4.4 Deldiskussion 4 ................................................................................................45<br />
7.5 Fermentering 5..........................................................................................................45<br />
7.5.1 Startbetingelser f5.............................................................................................45<br />
7.5.2 pH og temperatur f5..........................................................................................45<br />
7.5.3 Ilt f5 ..................................................................................................................46<br />
7.5.4 Sukker- og ethanolkoncentration f5 .................................................................46<br />
7.5.5 Deldiskussion 5 ................................................................................................47<br />
7.6 Tilledningsprofil .......................................................................................................47<br />
7.7 Fermentering 6..........................................................................................................48<br />
7.7.1 Startbetingelser f6.............................................................................................49<br />
7.7.2 pH og temperatur f6..........................................................................................49<br />
7.7.3 Ilt f6 ..................................................................................................................50<br />
7.7.4 Sukker- og ethanolkoncentration f6 .................................................................50<br />
7.7.5 Deldiskussion 6 ................................................................................................51<br />
7.8 Kulturrenhed.............................................................................................................51<br />
7.9 Prøveudtagning.........................................................................................................52<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae
K-PRO 7 Indholdsfortegnelse Gruppe 2<br />
8 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter...................................................53<br />
8.1 Respirationskoefficient.............................................................................................53<br />
8.1.1 Målinger på udgangsgassen..............................................................................54<br />
8.1.2 Respirationskoefficient fra fermentering f5 .....................................................56<br />
8.1.3 Beregning af antal mol CO2 dannet..................................................................56<br />
8.1.4 Beregning af antal mol O2 forbrugt ..................................................................57<br />
8.1.5 RQ.....................................................................................................................58<br />
8.2 Specifik væksthastighed ...........................................................................................59<br />
8.2.1 Beregning af den specifikke væksthastighed for f5..........................................59<br />
8.3 Udbyttekonstanter.....................................................................................................61<br />
8.4 Fermenteringsparametre ...........................................................................................64<br />
9 Diskussion.................................................................................................................... 66<br />
10 Konklusion ..................................................................................................................69<br />
11 Bilags- og måledataliste..............................................................................................71<br />
12 Litteraturliste..............................................................................................................72<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae
K-PRO 7 Problemformulering Gruppe 2<br />
1 Problemformulering<br />
1.1 Projektoplæg<br />
Projektet skal omhandle løsningen af et kemiingeniørrelevant emne. Emnet skal have<br />
relationer til praktiske ingeniørmæssige opgaver, normalt i samarbejde med en ekstern<br />
virksomhed.<br />
Herunder skal der formuleres en projektopgave. Opgaven analyseres og løses ved brug af<br />
indlært og selverhvervet viden samt ved inddragelse af anden relevant information. Dette<br />
afsluttes ved at udforme en teknisk rapport.<br />
1.2 Projektanalyse<br />
Formålet med projektet er at tilpasse forskellige parametre, så cellemasseudbyttet af gæren<br />
Saccharomyces cerevisiae senere kan optimeres. Dette sker som en videreføring af<br />
projektet ”Optimering af fed-batchfermentering af genmodificeret Saccharomyces cerevisiae”<br />
fra foråret 2003 af Forssling et al. i samarbejde med Novo Nordisk A/S.<br />
Inden der kan optimeres på forskellige parameter såsom pH eller temperatur under<br />
opformeringen, er det vigtigt at foretage nogle indledende forsøg. Hvis der skal optimeres på<br />
forskellige parameter er det vigtigt, at der ikke er begrænsende faktorer, der overskygger<br />
variationerne i de parameter, der optimeres på. Ønskes det eksempelvis at optimere på<br />
parameter X, er det vigtigt at parameter Y ikke er en begrænsende faktor, da parameter Y evt.<br />
har en større indflydelse på cellemasseudbyttet end parameter X.<br />
Hvis der opnås et cellemasseudbytte i nærheden af det teoretiske mulige, vil der ikke være<br />
nogen begrænsende parameter, der for alvor er dominerende. Herefter vil det så være mulig at<br />
optimere på forskellige parametre.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 1 af 73
K-PRO 7 Problemformulering Gruppe 2<br />
1.3 Projektformulering<br />
Der vil i dette projekt blive fokuseres på at tilpasse forskellige parametre til opformering af<br />
gæren Saccharomyces cerevisiae således, at der opnås et cellemasseudbytte tæt på den<br />
teoretiske værdi. Dette vil ske ved at foretage en opformering af gæren under bestemte<br />
forhold. Resultaterne fra denne opformering vil så blive vurderet, hvorefter nogle af<br />
forholdene ændres. Der vil derefter blive udført en ny opformering, under de nye forhold.<br />
Således anvendes der altså ikke en på forhånd fastlagt forsøgsplan.<br />
Resultaterne til vurdering af de forskellige opformeringer, vil komme fra analyser, der vil<br />
blive foretaget under den enkelte opformering. Der vil blive målt pH og temperatur for at<br />
kontrollere, at disse ligger stabilt under opformeringen, desuden vil iltkoncentrationen i<br />
fermenteringsvæsken blive målt, da det bedste cellemasseudbytte opnås ved aerobe forhold.<br />
Der vil derudover løbende blive udtaget prøver fra fermentoren, og disse prøver vil blive<br />
anvendt til at måle cellemasseudbyttet, samt finde koncentrationen af uomsat sukker og<br />
dannet ethanol i fermenteringsvæsken. Herudover måles på sammensætningen af<br />
udgangsgassen fra fermentoren, denne vil blive analyseret for indholdet af kuldioxid og<br />
nitrogen, således at indholdet af ilt kan beregnes.<br />
1.4 Projektafgrænsning<br />
Målingerne under fermenteringerne af pH, temperatur og iltkoncentrationen vil ske online vha.<br />
elektroder. Analyserne af sukker- og ethanolkoncentrationerne vil blive foretaget vha.<br />
enzymkit på et spektrofotometer, mens analyserne af udgangsgassen vil blive udført vha. en<br />
gaschromatograf. Cellemasseudbyttet vil blive målt ved tørstofanalyse.<br />
Startbetingelserne for fermenteringerne er fastlagt i samarbejde med Novo Nordisk A/S.<br />
Dette gælder for det substrat, der anvendes under fermenteringerne (opformering af gæren),<br />
samt den pH-værdi og temperatur, der anvendes.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 2 af 73
K-PRO 7 Insulin Gruppe 2<br />
2 Insulin<br />
Gæren Saccharomyces cerevisiae anvendes i industrien bl.a. til fremstilling af insulin. Denne<br />
fremstilling finder bl.a. sted på Novo Nordisk A/S, som er førende inden for fremstilling af<br />
insulin til mennesker (human insulin).<br />
2.1 Human insulin<br />
Insulin er det eneste hormon, der kan stimulere nedbrydning af sukkerstoffer, hvilket betyder<br />
at hvis der udskilles for lidt insulin, vil sukkerstoffer ophobes i kroppen. Dette fører til<br />
diabetes mellitus også kaldet sukkersyge. Hjerneceller bruger næsten udelukkende<br />
sukkerstoffer som energikilde, hvilket gør sukkersyge til en farlig sygdom. Dette skyldes, at<br />
svingende blodsukkerkoncentrationer i værste fald kan medføre hjerneskader, hvorfor<br />
sukkersyge kræver behandling.<br />
Insulin er et polypeptid, som består af 51 aminosyrer fordelt på to polypepti<strong>dk</strong>æder, en Akæde<br />
på 21 aminosyrer, hvor fire af aminosyrerne er cystein (CYS) og en B-kæde på 30<br />
aminosyrer, hvor to af aminosyrerne er cystein, se Figur 2.2. Cystein kan danne disulfidbroer<br />
med andre cysteingrupper. De to kæder er bundet sammen af to sådanne disulfidbroer, hvilket<br />
giver insulin sin tertiære struktur.<br />
Insulin produceres af β-cellerne i bugspytkirtlen som en enkeltkædet forbindelse, kaldet<br />
præ-pro-insulin, som ved udskillelse til cellen bliver foldet vha. disulfidbroer og danner<br />
proinsulin. Proinsulin består af en polypepti<strong>dk</strong>æde på 86 aminosyrer. Den primære struktur af<br />
proinsulinkæden består af A- og B-kæden og er bundet sammen vha. en tredje kæde, C-kæden,<br />
på 35 aminosyrer. Denne kæde medvirker til at holde A- og B-kæden i den rigtige position i<br />
forholdet til hinanden, således at de rigtige disulfidbroer kan dannes, se Figur 2.1. Efter<br />
dannelse af svovlbroer spaltes proinsulinproteinet ved enzymatisk katalyse, således at A-, og<br />
B-kæden frigøres, og proteinet opnår den ønskede tertiære struktur. [7]<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 3 af 73
K-PRO 7 Insulin Gruppe 2<br />
Figur 2.1: Human proinsulin Figur 2.2: Human insulin<br />
Insulin til regulering af blodsukker har tidligere været ekstraheret fra svinebugspytkirtler.<br />
Svineinsulin er dog ikke identisk med human insulin. Forskellen mellem svineinsulin og<br />
human insulin er aminosyre nr. 30. I human insulin er aminosyre nr. 30 threonin (THR), mens<br />
den i svineinsulin er alanin (ALA).<br />
β-cellerne reagerer på sukkerniveauet i blodet, dvs. ved en stigning af<br />
sukkerkoncentrationen til over det normale niveau 1 øges produktionen og den efterfølgende<br />
udskillelse af insulin med det resultat, at sukkerkoncentrationen i blodet falder. Som en<br />
konsekvens heraf falder produktionen og udskillelsen af insulin igen.<br />
Måden, hvorpå insulin regulerer optagelsen af bl.a. glucose, er ved at op- og nedregulere<br />
antallet af glucosetransportører på celleoverfladen, se Figur 2.3. Insulin binder sig til<br />
insulinreceptorer i den plasmamembran, der omslutter cellen. Dette bevirker, at der indsættes<br />
ekstra glucosetransportører i membranen. Disse glucosetransportører bliver opbevaret i<br />
membranvesicler 2 inde i cellen, se Figur 2.3. Modsat kan insulinen igen løsrives fra<br />
insulinreceptorerne, hvorefter membranvesiclerne gendannes og antallet af<br />
glucosetransportører i cellemembranen sænkes [20].<br />
1 Det normale niveau hos mennesker er 0,8 til 1,0 g pr.L [19].<br />
2 Membranvesicle: lille kugleformede hulrum inde i cellen til opbevaring af forskellige cellemembranenheder.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 4 af 73
K-PRO 7 Insulin Gruppe 2<br />
Figur 2.3: Overførsel af glucose gennem glucosetransportører fra blodåre til celle [20].<br />
Udover at insulin regulerer glucoseniveauet i blodet, har insulin også indflydelse på lagring<br />
og mobilisering af energi i primært leveren samt muskel- og fedtvæv. Insulinets virkning på<br />
disse væv varierer. Først fremmer insulin anvendelsen af glucose som energikilde, på samme<br />
tid fremmer det oplagringen af kulhydrater i form af polysakkaridet glycogen. For det andet<br />
reducerer insulin anvendelsen af fedt som energikilde, og fremmer oplagringen af det, hvilket<br />
stemmer overens med at glucose er en lettere tilgængelig energikilde end fedt. For det tredje<br />
reducerer insulin anvendelsen af proteiner som energikilde og fremmer dermed<br />
proteinsyntesen. [19]<br />
2.2 Industriel produktion af insulin<br />
På Novo Nordisk A/S fremstilles human insulin ved fermentering af en genmodificeret<br />
stamme af gæren Saccharomyces cerevisiae. Gærcellerne kan ved hjælp af et indsat plasmid<br />
producere et forstadie til insulin præ-pro-mini-insulin, også kaldet Mi3. Et plasmid er et<br />
ringformet DNA-molekyle, som ikke indeholder gener, der har betydning for cellens<br />
stofskifte, men derimod indeholder resistensgener [7]. C-kæden af Mi3 indeholder kun tre<br />
aminosyrer og er dermed meget kortere end C-kæden i naturligt pro-insulin, hvorfor det er<br />
nemmere at fjerne denne kæde kemisk. Selvom C-kæden er kortere, forhindrer dette ikke, at<br />
insulinmolekylet opnår den rigtige tertiære struktur [23].<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 5 af 73
K-PRO 7 Insulin Gruppe 2<br />
Ved at indsætte genet der koder for insulin på et plasmid i stedet for på et af gærcellens<br />
kromosomer opnås en stor insulinproduktion fra hver enkelt celle, da plasmider kan optræde i<br />
stort antal i hver celle.<br />
Dog er der en risiko for at cellerne taber plasmiderne, da det er meget energikrævende for<br />
cellerne at producere stoffer, som de ikke selv har brug for. Derfor er dele af et livsvigtigt<br />
enzym triose phosphat isomerase (TPI) fjernet fra cellernes kromosomer og i stedet sat ind i<br />
plasmidet. Dette betyder, at hvis cellen ikke indeholder plasmidet, kan denne ikke producere<br />
TPI og dermed ikke overleve. TPI er indsat i plasmidet således at hver gang dette produceres,<br />
vil der også blive produceret insulin. Herudover er genet for protease fjernet fra gærcellerne.<br />
Protease er et enzym, som nedbryder proteiner, inden de kan nå at blive udskilt til<br />
fermenteringsvæsken. Protease ville også nedbryde insulin, hvis enzymet var tilstede i S.<br />
cerevisiae [23].<br />
Produktion af insulin startes ved optøning af en ampul indeholdende genmodificerede S.<br />
cerevisiae celler, som herefter overføres til en fernbachkolbe 3 indeholdende et flydende agar<br />
med den nødvendige næring. Efter en vis opformering overføres kolbens indhold til en<br />
podetank, hvor cellerne opformeres i ca. 65 timer [22]. Herefter føres indholdet af podetanken<br />
over i hovedtanken, hvor fermenteringen fortsættes i 3 uger, forudsat at der ikke sker<br />
kontaminering undervejs. Hovedtanken er en kontinuert fermentor, dvs. at der under<br />
fermenteringen løbende fjernes fermenteringsvæske indeholdende Mi3 og tilledes frisk<br />
substrat, se Figur 2.4.<br />
Figur 2.4: Produktion af human insulin [23].<br />
3 En kolbe til podning af opformeringstank, som sterilt kan tilsluttes tanken.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 6 af 73
K-PRO 7 Insulin Gruppe 2<br />
Fermenteringen styres meget nøje med hensyn til pH, temperatur, iltindhold og substrat, så<br />
gæren har optimale vækstbetingelser. På Novo Nordisk A/S foregår fermenteringen ved ca. 30<br />
til 32 ºC og pH omkring 4 til 5. For nylig har Novo Nordisk A/S skiftet fra at anvende glucose<br />
som kulstofkilde til at anvende en flydende sukkeropløsning. Specielt sukkerkoncentrationen<br />
er meget vigtigt for fermenteringen. Hvis denne bliver for høj, vil sukkeret udelukkende blive<br />
omdannet under anaerobe betingelser, selvom der er ilt tilstede 4 . Herved vil uønskede<br />
biprodukter som f.eks. ethanol blive dannet, hvilket giver et mindre udbytte af cellemasse og<br />
dermed også et mindre udbytte af insulin. Når fermenteringen er færdig, oprenses<br />
fermenteringsvæsken. Først fjernes gærcellerne ved centrifugering og tromlefiltrering,<br />
hvorefter væsken opkoncentreres på forskellig vis alt efter hvilken type insulin der ønskes og i<br />
hvilken renhed [23].<br />
Opformeringen, som foregår i podetanken, er en batchfermentering, se Afsnit 4.1, hvilket<br />
vil sige at alt substrat tilsættes fra starten, og gærcellerne dermed har et stort overskud af<br />
sukker. Dette betyder, at nedbrydningen af sukker foregår under anaerobe forhold. Det burde<br />
derfor være muligt at få en bedre udnyttelse af sukkeret, hvis fermenteringen foregår som en<br />
fed-batch fermentering, hvor der startes ud med en vis mængde substrat i fermentoren, og<br />
herefter tilledes substrat kontinuert, se Afsnit 4.2. Hermed er det muligt at opnå en vis<br />
nedbrydning af sukker under aerobe forhold og dermed få et større cellemasseudbytte, se<br />
Afsnit 3.2.<br />
4 Denne effekt kaldes Crabtree-effekten, se Afsnit 3.4.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 7 af 73
K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces ceerevisiae Gruppe 2<br />
3 Vækst af Saccharomyces cerevisiae<br />
3.1 Saccharomyces cerevisiae<br />
Den gær, der anvendes til industriel fremstilling af insulin og som vil blive anvendt i dette<br />
projekt, er som tidligere nævnt en genmodificeret stamme af Saccharomyces cerevisiae.<br />
S. cerevisiae bedre kendt som bage- eller ølgær er sammen med mange andre gærtyper<br />
gennem de sidste årtusinder blevet anvendt til fremstilling af f.eks. vin, øl og brød ved<br />
fermentering [10], [11]. I nyere tid har genmodificeret gær fundet anvendelse som vært ved<br />
fremstilling af proteiner [7].<br />
S. cerevisiae er en eukaryote nærmere betegnet en encellet gær, som har en diameter på<br />
omkring 5 til 10 µm [7] [9]. Gærceller er dermed meget større end bakterier og kan nemt<br />
skelnes fra disse mikroskopisk [7] [9]. S. cerevisiae er en af de mest undersøgte gærtyper og<br />
den første, hvis genom blev fuldstændig kortlagt [7].<br />
S. cerevisiae deler sig ved celleafsnøring, se Figur 3.1, hvor en ny celle, kaldet dattercelle,<br />
dannes som en lille udvækst på modercellen. Når dattercellen har en vis størrelse sker der en<br />
adskillelse af cellerne. Umiddelbart herefter kan modercellen igen dele sig ved celleafsnøring.<br />
Dattercellen derimod skal først modnes, før denne kan påbegynde celledeling [7], [12].<br />
Figur 3.1: Celledeling ved celleafsnøring i S. cerevisiae [7].<br />
Grundene til at S. cerevisiae anvendes til industriel produktion af insulin er mange, bl.a. er<br />
gærceller i stand til at danne et korrekt foldet molekyle med de svovlbroer, der er<br />
karakteristiske for insulin, se Afsnit 2.1. Derudover udskilles insulinet til<br />
fermenteringsvæsken samtidig med, at der udskilles relativt få andre proteiner, dette gør<br />
oprensningen lettere. S. cerevisiae celler er robuste, vokser hurtigt og kan gro meget tæt,<br />
hvilket giver et højt udbytte. Desuden kan S. cerevisiae vokse på et simpelt og billigt substrat<br />
[23].<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 8 af 73
K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces ceerevisiae Gruppe 2<br />
3.2 Metabolisme for S. cerevisiae<br />
For at kunne opdyrke en population af S. cerevisiae er det nødvendigt at gæren får opfyldt de<br />
vækstparametre den kræver, det vil bl.a. sige at få et optimalt tilpasset substrat.<br />
Hovedingrediensen i dette substrat vil være en kulstofkilde som f.eks. glucose eller sukker.<br />
Herudover kræver gæren en nitrogenkilde, en fosforkilde samt mange forskellige mineraler og<br />
sporstoffer. Udover dette kræver gæren ilt for at kunne vokse optimalt under aerobe forhold,<br />
hvilket giver det største cellemasseudbytte, se Afsnit 3.2.1.<br />
S. cerevisiae er en fakultativ aerob gær, dvs. den kan omsætte sukker ved både aerob og<br />
anaerob nedbrydning [15], [10]. S. cerevisiae vil ikke kunne optimeres til at omsætte sukker<br />
fuldstændig aerobt. Det er kun muligt at omsætte mellem 3 og 20 % af sukkeret under aerobe<br />
forhold [15], derfor vil metabolismen for S. cerevisiae være både aerob og anaerob.<br />
3.2.1 Udbyttekonstanter<br />
For at få en ide om hvor stort et cellemasseudbytte det er muligt at opnå ved fermentering af S.<br />
cerevisiae undersøges den maksimale udbyttekonstant, når der tages højde for både aerob og<br />
anaerob nedbrydning af sukker. Dette gøres beregningsmæssigt med glucose.<br />
Idet S. cerevisiae maksimalt kan nedbryde 20 % af sukkeret under aerobe forhold, kan den<br />
maksimalt opnåelige udbyttekonstant ud fra teoretiske udbyttekonstanter opskrives som:<br />
aerob<br />
anaerob<br />
Y X = 0,<br />
20⋅<br />
Y + ( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
⋅ Y<br />
S max<br />
X<br />
S<br />
Ud fra litteraturen er der fundet flere udbyttekonstanter for både aerob og anaerob vækst,<br />
disse udbyttekonstanter er fundet for cellemasse ud fra et substrat bestående af glucose. For at<br />
kunne vælge hvilken der sammenlignes med i dette projekt, udregnes den maksimale<br />
aerob<br />
udbyttekonstant, X max<br />
S<br />
Y , ud fra de fundne værdier [3], [2]:<br />
aerob anaerob<br />
(I) : Y X = 0,50 , Y X = 0,15<br />
g biomasse dannet g biomasse dannet<br />
S<br />
g glucose forbrugt<br />
S<br />
g glucose forbrugt<br />
aerob anaerob<br />
(II) : Y X = 0,67 , Y X = 0,11<br />
g biomasse dannet g biomasse dannet<br />
S<br />
g glucose forbrugt<br />
S<br />
g glucose forbrugt<br />
Hvis der kun tages højde for nedbrydningen af substrat, i dette tilfælde glucose ved aerob<br />
og anaerob nedbrydning, fås følgende maksimalt opnåelige udbyttekonstanter:<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 9 af 73<br />
X<br />
S
K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces ceerevisiae Gruppe 2<br />
Y<br />
Y<br />
Y<br />
X<br />
S max<br />
X<br />
S max<br />
X<br />
S max<br />
aerob<br />
anaerob<br />
aerob<br />
= 0,<br />
20⋅<br />
Y + ( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
⋅ Y<br />
Y X = 0,<br />
20⋅<br />
Y + ( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
= 0,<br />
20⋅<br />
0,<br />
50 +<br />
= 0,<br />
220<br />
X<br />
S<br />
( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
X<br />
S<br />
⋅0,<br />
15<br />
= 0,<br />
222<br />
( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 10 af 73<br />
Y<br />
Y<br />
S max<br />
X<br />
S max<br />
X<br />
S max<br />
X<br />
S<br />
= 0,<br />
20⋅<br />
0,<br />
67 +<br />
(I) (II)<br />
⋅ Y<br />
⋅0,<br />
11<br />
anaerob<br />
X<br />
S<br />
Hvis der samtidig med nedbrydningen af glucose tages højde for aerob nedbrydning af den<br />
ethanol, der dannes ved den anaerobe glucosenedbrydning, er det muligt at estimere '<br />
er defineret som:<br />
Y<br />
anaerob <br />
+ ( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
⋅<br />
Y X + YE<br />
⋅ X <br />
S<br />
S E <br />
' X aerob<br />
= 0,<br />
20⋅<br />
Y<br />
S<br />
X<br />
Y<br />
max<br />
S<br />
Dette kræver dog, at udbyttekonstanterne E<br />
S<br />
Y og X<br />
E<br />
Y kendes, hvor<br />
Y ,der<br />
X<br />
S<br />
Y E er massen af ethanol<br />
S<br />
dannet set i forhold til massen af substrat forbrugt, i dette tilfælde glucose og<br />
cellemasse dannet set i forhold til massen af ethanol forbrugt.<br />
YX E<br />
er massen af<br />
Y<br />
Y<br />
Y<br />
' X<br />
S max<br />
' X<br />
S max<br />
' X<br />
S max<br />
aerob<br />
anaerob<br />
'<br />
= 0,<br />
20⋅<br />
Y + ( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
⋅ Y + YE<br />
⋅ Y X Y X<br />
aerob<br />
= 0,<br />
20⋅<br />
Y + ( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
= 0,<br />
20⋅<br />
0,<br />
50 +<br />
= 0,<br />
463<br />
X<br />
S<br />
<br />
<br />
<br />
X<br />
S<br />
( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
⋅(<br />
0,<br />
15 + 0,<br />
41⋅<br />
0,<br />
74)<br />
S<br />
E<br />
<br />
<br />
<br />
Y<br />
Y<br />
S max<br />
' X<br />
S max<br />
' X<br />
S max<br />
= 0,<br />
20⋅<br />
0,<br />
67 +<br />
= 0,<br />
465<br />
(I) (II)<br />
X<br />
g biomasse dannet<br />
= 0,<br />
74<br />
[2]<br />
g ethanol dannet<br />
hvor Y E = 0,<br />
41 og Y<br />
g glucose forbrugt<br />
g ethanol forbrugt<br />
S<br />
E<br />
X<br />
S<br />
<br />
⋅<br />
Y<br />
<br />
anaerob<br />
X<br />
S<br />
+ Y<br />
E<br />
S<br />
( 1−<br />
0,<br />
20)<br />
⋅(<br />
0,<br />
11+<br />
0,<br />
41⋅<br />
0,<br />
74)<br />
Ved at tage højde for den aerobe nedbrydning af ethanol er det muligt at opnå et teoretisk<br />
udbytte på ca. 0,46 til 0,47 g cellemasse pr. g glucose forbrugt mod kun 0,22 g cellemasse pr.<br />
g glucose forbrugt uden hensyntagen til nedbrydning af ethanol. Det vil være<br />
udbyttekonstanten på 0,46 til 0,47 g biomasse pr. g substrat, der vil stræbes efter at nå i dette<br />
projekt.<br />
Som det ses af den ovenstående beregning er forskellen mellem (I) og (II) ved beregning<br />
' af Y X , meget lille ved brug af de forskellige teoretiske udbyttekonstanter. Derfor vælges at<br />
S<br />
aerob g biomasse dannet<br />
anaerob g biomasse dannet<br />
anvende (I): Y X = 0,<br />
50<br />
og Y<br />
g glucose forbrugt<br />
X 0,<br />
15<br />
g glucose forbrugt<br />
S<br />
S<br />
⋅ Y<br />
= til beskrivelse af den<br />
teoretiske vækst for S. cerevisiae. Nedbrydningen af glucose foregår som nævnt ved både<br />
X<br />
E
K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces ceerevisiae Gruppe 2<br />
aerob og anaerob nedbrydning samt aerob nedbrydning af ethanol. Disse<br />
nedbrydningsreaktioner er beskrevet i Afsnit 3.2.2:<br />
3.2.2 Metabolismeligninger<br />
Aerob nedbrydning af glucose<br />
Ved aerob nedbrydning omdannes glucose hovedsageligt til cellemasse:<br />
a C6<br />
H12O<br />
6 + b NH3<br />
+ d O 2 → C6H<br />
10,<br />
9O1,<br />
03N<br />
3,<br />
06 + e CO 2 + f H 2O<br />
(a)<br />
aerob<br />
g biomasse produceret<br />
hvor Y X 0,<br />
50<br />
S<br />
g glucose forbrugt<br />
= , hvilket medfører:<br />
1, 58 C6<br />
H12O<br />
6 + 3,<br />
06 NH 3 + 3,<br />
57 O 2 → C 6H<br />
10,<br />
9O1,<br />
03N<br />
3,<br />
06 + 3,<br />
49 CO 2 + 8,<br />
63H<br />
2O<br />
(b)<br />
Anaerob nedbrydning af glucose<br />
Figur 3.2: (a) Aerob nedbrydning af glucose [3].<br />
(b) Aerob støkiometrisk nedbrydning af glucose.<br />
Ved anaerob nedbrydning omsættes glucose til cellemasse samt kuldioxid og ethanol:<br />
a C H O<br />
+<br />
6<br />
12<br />
6 + b NH3<br />
→ C6H<br />
10,<br />
9O1,<br />
03N<br />
3,<br />
06 + d H 2O<br />
+ eCH<br />
3CH<br />
2OH<br />
f CO 2 (a)<br />
anaerob<br />
g biomasse produceret<br />
hvor Y<br />
X 0,<br />
15<br />
S<br />
g glucose forbrugt<br />
= , hvilket medfører:<br />
5,27C6H12O6 + 3,06NH3 → C6H10,9O1,03N3,06 + 5,06H2O+ 8,57CH3CH2OH+ 8,48CO2<br />
(b)<br />
Aerob nedbrydning af ethanol<br />
Figur 3.3: (a) Anaerob nedbrydning af glucose [3].<br />
(b) Anaerob støkiometrisk nedbrydning af glucose.<br />
Ved anaerob nedbrydning af glucose dannes en del ethanol, som ved tilstedeværelse af ilt kan<br />
omdannes til yderligere cellemasse og kuldioxid:<br />
a CH 3 CH 2OH<br />
+ b NH 3 + d O 2 → C6<br />
H10,<br />
9O1,<br />
03N<br />
3,<br />
06 + e CO 2 + f H 2O<br />
(a)<br />
g biomasse produceret<br />
hvor Y X 0,<br />
74<br />
g ethanol forbrugt<br />
E<br />
= , hvilket medfører:<br />
4 2<br />
, 18 CH 3 CH 2OH<br />
+ 3,<br />
06 NH 3 + 6,<br />
61O<br />
2 → C 6H<br />
10,<br />
9O1,<br />
03N<br />
3,<br />
06 + 2,<br />
35CO<br />
2 + 11,<br />
67 H O (b)<br />
Figur 3.4: (a) Aerob nedbrydning af ethanol [3].<br />
(b) Aerob støkiometrisk nedbrydning af ethanol.<br />
Det er valgt at anvende samme kemiske formel for cellemasse, som der blev anvendt i<br />
Forssling et al.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 11 af 73
K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces ceerevisiae Gruppe 2<br />
Ud fra de tidligere definerede udbyttekonstanter er det muligt at udregne konstanterne a til<br />
f i de tre reaktionsligninger, se Figur 3.2, Figur 3.3 og Figur 3.4(b).<br />
Ud fra ovenstående ligninger ses det tydeligt, at der dannes langt mere kuldioxid ved<br />
anaerob nedbrydning af glucose og den efterfølgende omsætning af ethanol end ved aerob<br />
nedbrydning af glucose. Ud fra denne teoretiske betragtning vurderes, at det vil være muligt at<br />
kunne måle forskellen mellem dannelsen af kuldioxid ved aerob og anaerob vækst<br />
eksperimentalt vha. respirationskvotienten, og derved bestemme om fermenteringen forløber<br />
under aerobe eller anaerobe forhold.<br />
3.2.3 Respirationskoefficient<br />
De analyser, der vil blive udført på udgangsgassen, kan anvendes til at vurdere<br />
respirationskoefficienten (RQ) med. Respirationskvotienten er en anvendelig måde til at<br />
bestemme, hvorvidt en fermentering foregår under aerobe eller anaerobe forhold.<br />
Respirationskvotienten er defineret som [3]:<br />
RQ =<br />
mol CO2<br />
dannet<br />
mol O2<br />
forbrugt<br />
Værdier større end 1 indikerer dannelse af ethanol og dermed anaerobe forhold, værdier<br />
under 0,6 indikerer ethanolnedbrydning, mens værdier mellem 0,6 og 1,0 indikerer aerob<br />
vækst [3], [22].<br />
Ud fra Figur 3.2, Figur 3.3 og Figur 3.4 er det muligt at beregne respirationskoefficienten<br />
for aerob og anaerob nedbrydning af glucose samt aerob nedbrydning af ethanol:<br />
3, 49 mol<br />
RQaerob glucose = = 0,98<br />
3,57 mol<br />
2,35mol<br />
RQaerob ethanol = = 0,36<br />
6,61mol<br />
8, 48mol<br />
RQanaerob glucose = = lim RQ→∞<br />
molO forbrugt →0<br />
O2→0 2<br />
Som det ses af ovenstående beregninger ligger den teoretiske respirationskvotient for aerob<br />
nedbrydning af glucose på 0,98; hvilket passer med definitionen på en RQ liggende mellem<br />
0,6 og 1,0. Den teoretiske respirationskvotient for aerob nedbrydning af ethanol er beregnet til<br />
0,36; og denne skulle være under 0,6; hvilket også passer fint.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 12 af 73
K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces ceerevisiae Gruppe 2<br />
Det er ikke muligt at beregne den teoretiske respirationskoefficient for anaerob<br />
nedbrydning af glucose, idet der ikke indgår ilt i reaktionsligningen. Dog ses det at<br />
respirationskoefficienten er over 1,0. I praksis vil det være muligt at beregne RQ, da indholdet<br />
af ilt og kuldioxid i udgangsgassen til et givet tidspunkt kan beregnes, se Afsnit 8.1.<br />
3.3 Pasteur-effekt<br />
Tilstedeværelsen af ilt inhiberer S. cerevisiaes fermenteringsevne under aerobe forhold, det vil<br />
sige at omsætningen af sukker forløber hurtigere ved anaerobe forhold end ved aerobe forhold,<br />
uden forbrug af ilt. Denne effekt kaldes Pasteur-effekten [15].<br />
g<br />
Pasteur-effekten ses kun i S. cerevisiae ved sukkerkoncentrationer under ca. 1 [15] eller<br />
L<br />
ved mangel på en vigtig vækstfaktor. Drejer det sig dog om mangel på en nitrogenkilde, har<br />
det ikke nævneværdig indvirkning på den aerobe væksthastighed, men derimod på den<br />
anaerobe væksthastighed [15].<br />
Ved opformering af S. cerevisiae vil cellerne som tidligere nævnt kun kunne nedbryde<br />
mellem 3 til 20 % af sukker ved aerobe forhold sammenlignet med aerob nedbrydning på 25<br />
til 100 % for celler i dvale [15]. Da celler i vækst nedbryder sukker hurtigere end celler i<br />
dvale, fås hurtigere en lav sukkerkoncentration. Dermed vil Pasteur-effekten ses tydeligere for<br />
celler i vækst [15].<br />
3.4 Crabtree-effekt<br />
Hvis koncentrationen af tilgængeligt sukker er høj, vil Pasteur-effekten ikke længere have<br />
nogen indvirkning på fermenteringen, idet denne som nævnt kun er aktiv ved<br />
g<br />
sukkerkoncentrationer under ca. 1 , herimod vil Crabtree-effekten aktiveres. Crabtree-<br />
L<br />
effekten bevirker, at metabolismen ændres fra aerob til anaerob ved sukkerkoncentrationer<br />
g<br />
over 0,5 til 1,0 [17], [16], selvom der er ilt tilstede i fermentoren, og dermed vil der blive<br />
L<br />
dannet ethanol, se Figur 3.5.<br />
Crabtree-effekten er særlig udbredt i forbindelse med sukkerfølsomme gærtyper som S.<br />
cerevisiae [15], [2]. For at undgå Crabtree-effekten er det nødvendigt at kunne regulere<br />
g<br />
tilledningen af substrat, så sukkerkoncentrationen ikke overstiger 0,5 til 1,0 . Det vil derfor<br />
L<br />
være fordelagtigt at anvende fed-batch fermentering, da det på den måde er muligt ikke at<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 13 af 73
K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces ceerevisiae Gruppe 2<br />
lede større mængder substrat til fermentoren end cellerne har brug for. Dette vil være meget<br />
effektivt, hvis det er muligt at måle sukkerkoncentrationen online.<br />
C6H12O6 glucose<br />
anaerob<br />
C 3 H 3 O 3 -<br />
CH 3 CH 2 OH<br />
ethanol<br />
pyruvat<br />
+<br />
CO 2<br />
aerob<br />
aerob<br />
C 6 H 10 , 9 O 1 , 03 N 3 , 06<br />
cellemasse<br />
+ CO 2<br />
Figur 3.5: Glucose omdannes til pyruvat, som alt efter om der er aerobe eller anaerobe forhold bliver til<br />
henholdsvis cellemasse og kuldioxid eller ethanol og kuldioxid [17]<br />
En anden måde at beskrive begrænsningen i S. cerevisiaes anvendelse af sukker under<br />
aerobe forhold på er overflowsmetabolisme, som er skitseret i Figur 3.6. Ved tilfælde 1 er der<br />
overskydende kapacitet til nedbrydning af substrat, hvorfor det hele bliver omsat ved aerob<br />
vækst. I tilfælde 2 bliver det tilstedeværende substrat omsat aerobt, men en forøgelse af<br />
koncentrationen vil medføre dannelse af ethanol, anaerobe forhold. I tilfælde 3 er<br />
substratkoncentrationen højere end gærens nedbrydningskapacitet ved aerobe forhold og<br />
dermed vil der blive dannet ethanol, selvom der er ilt tilstede [17]. For at undgå<br />
ethanoldannelse under opformering af S. cerevisiae, så der lige akkurat opnås tilfælde 2, se<br />
Figur 3.6, skal tilledningen af substrat styres [17].<br />
3.5 Substratinhibering<br />
Figur 3.6: Overflowsmetabolisme [17].<br />
Udover Crabtree-effekt ved høje sukkerkoncentrationer kan der også forekomme inhibering af<br />
enzymaktiviteten ved høje substratkoncentrationer. Disse substratkomponenter kan være<br />
forskellige proteiner, vitaminer og lignende. Inhibering sker ved, at en inhibitor binder sig til<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 14 af 73
K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces ceerevisiae Gruppe 2<br />
enzymet, som herved ikke kan binde sig til sukkermolekyler. Denne type inhibering kaldes<br />
kompetitiv, se Figur 3.7a). Alternativt kan en inhibitor binde sig til enzym-sukkerkomplekset<br />
og dermed inhiberes omdannelsen af sukkeret, dette kaldes unkompetitiv inhibering, se Figur<br />
3.7b) [8].<br />
a) Kompetitiv inhibering. b) Unkompetitiv inhibering.<br />
Figur 3.7: Enzyminhibeirng [8], hvor E: Enzym, S: Sukker, I: Inhibitor og P: Produkt.<br />
Kompetitiv inhibering vil ikke fuldstændigt kunne forhindre omdannelse af sukker, men vil<br />
bevirke en lav koncentration af frit enzym, hvorimod unkompetitiv inhibering vil forhindre, at<br />
enzymet katalyserer omdannelsen af sukker, idet inhibitoren som sagt sætter sig på enzymsukkerkomplekset<br />
[8]. Kompetitiv og unkompetitiv inhibering er reversible, og derfor vil det<br />
være muligt at ophæve disse, hvis indholdet af inhibitorer reduceres. Ved at tillede substratet<br />
løbende under fermenteringen, så substratkoncentrationerne ikke når over et vist niveau, er<br />
det muligt at undgå substratinhibering. Løbende substrattilledning ses ved både fed-batch og<br />
kontinuert fermentering, se Afsnit 4.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 15 af 73
K-PRO 7 Fermenteringsteori Gruppe 2<br />
4 Fermenteringsteori<br />
Der findes forskellige fermenteringstyper, tre af disse er batch, fed-batch og kontinuert<br />
fermentering, som gennemgås herunder.<br />
4.1 Batch fermentering<br />
Ved batch fermentering placeres gærceller i en lukket fermentor indeholdende substratet og<br />
inkuberes under optimale vækstbetingelser, se Figur 4.1a). Der er ikke noget flow ind i eller<br />
ud af fermentoren under fermenteringen bortset fra luftflow gennem fermentoren samt<br />
tilsætning af base og syre til regulering af pH [9]. Dette betyder, at substratet i fermentoren<br />
indeholder alle de næringssalte, vitaminer og sporstoffer, som gæren har brug for, i høje<br />
koncentrationer, hvilket kan medføre substratinhibering, se Afsnit 3.5. Derudover indeholder<br />
substratet også en høj sukkerkoncentration, hvilket betyder, at væksten vil foregå under<br />
anaerobe betingelser pga. Crabtree-effekten, se Afsnit 3.4.<br />
Under fermenteringen vil sukkerkoncentrationen falde, mens indholdet af cellemasse vil<br />
stige, se Figur 4.1b). En batch fermentering vil dog give et lavere udbytte end fed-batch<br />
fermentering pga. anaerob vækst under hele fermenteringen, se Afsnit 4.2.<br />
4.2 Fed-batch fermentering<br />
a) b)<br />
Figur 4.1: a) Skematisk oversigt over batch fermentering<br />
b) ----- sukkerkoncentration som funktion af tiden<br />
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ cellemasse som funktion af tiden [9].<br />
Ved fed-batch fermentering startes fermenteringen som ved batch fermentering, dvs. at der er<br />
overskud af alle næringsstoffer, hvilket som nævnt kan medføre både substratinhibering og<br />
Crabtree-effekt. Herudover tilledes yderligere substrat, se Figur 4.2a). Efter en vis periode er<br />
både substrat- og sukkerkoncentrationen faldet så meget, at der ikke længere er hverken<br />
substratinhibering eller Crabtree-effekt, og sukkerkoncentrationen er i stedet blevet den<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 16 af 73
K-PRO 7 Fermenteringsteori Gruppe 2<br />
begrænsende faktor, se Figur 4.2b). På denne måde er det muligt at forlænge vækstfasen og<br />
dermed øge cellemasseudbyttet i forhold til batch fermentering.<br />
a) b)<br />
Figur 4.2: a) Skematisk oversigt over fed-batch fermentering<br />
b) ----- sukkerkoncentration som funktion af tiden<br />
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ cellemasse som funktion af tiden [9].<br />
4.3 Kontinuert fermentering<br />
Ved kontinuert fermentering fjernes fermenteringsvæske kontinuert fra fermentoren og<br />
samtidig tilsættes frisk substrat med samme hastighed, herved er det muligt at opretholde en<br />
høj cellekoncentration, se Figur 4.3.<br />
Ved kontinuert fermentering er det vigtigt at styre fortyndingshastigheden, dvs. den<br />
hastighed hvormed det friske substrat tilsættes og fermenteringsvæsken fjernes, da for høje<br />
fortyndingshastigheder kan medføre udvaskning af gærcellerne [15], [6].<br />
a) b)<br />
Figur 4.3: a) Skematisk oversigt over kontinuert fermentering<br />
b) ----- sukkerkoncentration som funktion af tiden<br />
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ cellemasse som funktion af tiden [9].<br />
4.4 Vækstfaser for gærceller<br />
Vækst af gærceller sker i fire faser. Ved tilsætning af en cellestamme til et substrat vil der<br />
forekomme en vis nølefase, mens cellerne vender sig til de nye forhold. Herefter begynder<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 17 af 73
K-PRO 7 Fermenteringsteori Gruppe 2<br />
den eksponentielle fase, hvor cellernes væksthastighed er størst. Ved batch fermentering kan<br />
den eksponentielle fase ikke fortsætte i længere tid, da der enten er en begrænset mængde af<br />
næringsstoffer tilstede, og der bliver ikke tilført yderligere næring, eller ved ophobning af et<br />
inhiberende produkt. Derfor går cellerne over i en ny fase kaldet den stationære fase, hvor der<br />
hverken sker nogen forøgelse eller nedgang i celleantallet. Efter en længere periode i den<br />
stationære fase overgår kulturen til dødsfasen, simpelthen fordi der ikke er flere<br />
næringsstoffer tilbage, og cellerne dør, se Figur 4.4 [7].<br />
Ved fed-batch fermentering er det muligt at opretholde den eksponentielle vækstfase<br />
længere end ved batch fermentering, da der tilledes frisk substrat, men også her vil<br />
cellekulturen overgå til den stationære fase, idet affaldsprodukter og inhiberende biprodukter<br />
vil ophobes i fermenteringsvæsken. Derimod vil det ved kontinuert fermentering være muligt<br />
at opretholde den eksponentielle fase i en lang periode, da der både tilledes frisk substrat og<br />
samtidig fjernes fermenteringsvæske. Dette betyder, at alle de nødvendige næringsstoffer er til<br />
stede i fermentoren samtidig med at inhiberende produkter fjernes løbende, så disse ikke<br />
opnår en koncentration, der er høj nok til at inhibere væksten.<br />
Figur 4.4: En typisk vækstkurve for mikroorganismer [7].<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 18 af 73
K-PRO 7 Betydningen af ilt og omrøring Gruppe 2<br />
5 Betydningen af ilt og omrøring<br />
Da S. cerevisiae som tidligere nævnt maksimalt kan nedbryde 20 % af den tilgængelige<br />
mængde sukker under aerobe forhold, er det vigtigt at have et højt indhold af ilt i<br />
fermenteringsvæsken, så det er muligt for gæren at opnå den maksimale aerobe nedbrydning.<br />
Der vil ved den resterende anaerobe vækst dannes en vis mængde ethanol, som ved en høj ilt<br />
tilgængelighed kan omdannes til yderligere cellemasse. Kan ethanol ikke nedbrydes pga. lav<br />
ilt tilgængelighed, vil denne blive ophobet og kan dermed inhibere væksten af S. cerevisiae.<br />
5.1 Ilts opløselighed i væske<br />
For at undersøge betydningen af iltoverførslen samt omrørerhastigheden er det nødvendigt at<br />
vide hvor meget ilt der i teorien kan opløses i væsken. I dette afsnit beregnes ilts opløselighed<br />
i vand, som så senere kan sammenlignes med opløsningen af ilt i fermenteringsvæske.<br />
For at beregne opløseligheden skal ligevægten mellem ilt i gasfasen og i væskefasen kendes:<br />
O2(g) O2(aq)<br />
Ligevægten kan opskrives på følgende måde, hvor KH er Henrys lov konstant:<br />
Partialtrykket af ilt findes på følgende måde:<br />
C<br />
K C K p<br />
O2(aq)<br />
H = O =<br />
2(aq) H⋅ O2(g)<br />
pO2(g)<br />
p O =<br />
2(g)<br />
Til beregningerne benyttes følgende formel:<br />
y O · P<br />
2(g) total<br />
[ ]<br />
mg mol<br />
g mg<br />
C O 2(aq) KH y L L bar O 2(g) Ptotalbar M O 1000 <br />
<br />
= ⋅ ⋅ ⋅ ⋅<br />
⋅ <br />
2 mol g <br />
y O = 0,209; se Tabel 8.1<br />
2(g)<br />
M O = 31,9988<br />
2<br />
g<br />
mol<br />
For værdier af H K , se Tabel 6.2.<br />
For ilts opløselighed ved forskellige overtryk og temperaturer, se Figur 5.1.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 19 af 73
K-PRO 7 Betydningen af ilt og omrøring Gruppe 2<br />
16<br />
14<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1<br />
Overtryk [bar]<br />
8,6<br />
8,4<br />
8,2<br />
8,0<br />
7,8<br />
7,6<br />
7,4<br />
7,2<br />
7,0<br />
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36<br />
Temperatur [°C]<br />
Overtryk<br />
[bar]<br />
Ilts opløselighed<br />
mg <br />
L <br />
Temperatur<br />
[°C]<br />
Ilts opløselighed<br />
mg <br />
L <br />
0,0 7,79 25 8,48<br />
0,1 8,56 26 8,33<br />
0,2 9,33 27 8,18<br />
0,3 10,10 28 8,04<br />
0,4 10,87 29 7,91<br />
0,5 11,64 30 7,79<br />
0,6 12,41 31 7,65<br />
0,7 13,18 32 7,53<br />
0,8 13,95 33 7,41<br />
0,9 14,71 34 7,29<br />
1,0 15,48 35 7,18<br />
a) Trykafhængighed ved T = 30 °C b) Temperaturafhængighed P = 1 atm<br />
Figur 5.1: Opløseligheden af ilt i forhold til tryk og temperatur.<br />
Det ses af Figur 5.1, at en lille trykændring har en større indflydelse på opløseligheden af<br />
ilt i vand end en temperaturændring inden for de intervaller, hvor disse er beregnet.<br />
5.2 Iltoverførsel<br />
Under fermenteringerne er der anvendt en omrørerhastighed på 400 O<br />
min ved fermentering 1, 2<br />
og 3, herefter blev omrørerhastigheden øget til 700 O<br />
min ved fermentering 4, 5 og 6, se Afsnit<br />
7.3.4. Da der under fermenteringerne er anvendt to forskellige omrørerhastigheder undersøges,<br />
om dette har en effekt på iltoverførslen.<br />
Iltoverførslen fra luften til mikroorganismerne kan opdeles i 3 trin [3].<br />
1 - Overførsel af ilt fra en luftboble til væsken.<br />
2 - Transport af opløst ilt gennem væsken til mikroorganismen.<br />
3 - Optagelse af opløst ilt fra væsken til mikroorganismen.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 20 af 73
K-PRO 7 Betydningen af ilt og omrøring Gruppe 2<br />
Det har i praksis vist sig, at det begrænsende trin ofte er trin 1, derfor er det overførsel af ilt<br />
fra en luftboble til væsken, der vil blive set nærmere på her.<br />
Overførslen af ilt fra luftbobler til væske kan beskrives med følgende udtryk [3], [13]:<br />
d C<br />
d t<br />
O2<br />
= K<br />
L<br />
⋅ a ⋅<br />
( C − C )<br />
O2<br />
mættet<br />
hvor : KL : masseoverførselskoefficient [m/s]<br />
a : gas-væske kontaktflade pr. væskevolumen [m 2 /m 3 ]<br />
Det er ofte svært at måle både KL og a hver for sig i praksis, derfor måles de ofte som én<br />
konstant KLa[s -1 ] også kaldet den volumetriske masseoverførselskoefficient. Jo højere en<br />
værdi KLa antager, jo bedre er iltoverførslen.<br />
Det er muligt at bestemme KLa på flere måder, blandt andet ud fra nedenstående ligning<br />
samt ud fra en række forsøg. Begge dele er gjort for den MBR fermentor, som er anvendt i<br />
dette projekt, se Bilag 1. KLa kan estimeres ud fra følgende ligning [3], [13]:<br />
P Ka= k⋅ ⋅ V<br />
V<br />
<br />
<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 21 af 73<br />
x<br />
( )<br />
beluftet<br />
L s<br />
hvor : Pbeluftet : Effektforbruget til iltoverførslen [W]<br />
V : Væskens volumen [m 3 ]<br />
Vs : Den lineære gashastighed [m/s]<br />
k,x og y : Konstanter<br />
Ovenstående formel gælder under følgende betingelser:<br />
y<br />
O2<br />
Pbeluftet<br />
V : 2 – 4400 L og<br />
V : 500 – 10.000 W<br />
3<br />
m<br />
5.2.1 Sammenligning af estimeret KLa ogpraktiskKLa<br />
De fundne værdier for KLa ved estimering og forsøg sammenlignes, se Tabel 5.1.<br />
Nomdrejninger<br />
O min <br />
KLaestimeret<br />
[s -1 ]<br />
KLapraktisk<br />
[s -1 ]<br />
400 0,030 0,0123<br />
700 0,132 0,0198<br />
Tabel 5.1: Estimeret og praktisk KLa fra Bilag 1.
K-PRO 7 Betydningen af ilt og omrøring Gruppe 2<br />
De praktisk bestemte værdier for KLa er, som det ses af Tabel 5.1, meget mindre end de<br />
estimerede værdier, men der sker dog stadig en stigning fra 400 O<br />
min til 700 O<br />
min ved begge<br />
metoder. Den store forskel fra de praktiske til de estimerede værdier kan skyldes de<br />
konstanter der er indsat for k, x og y i formlen for udregning af KLaestimeret. Konstanterne<br />
gælder for fermentorer på mellem 2 og 4400 L, hvilket er et meget stort interval. Samtidig<br />
gælder formlen for omrørte fermentorer uafhængigt af omrørertype og antallet af<br />
omrørerblade samt udformningen af iltfordeler [3]. Pga. disse forhold vil der være en del<br />
usikkerhed på de estimerede værdier.<br />
Dog skal det nævnes, at der er fundet KLa værdier i litteraturen på 0,090 s -1 og 0,278 s -1 ved<br />
henholdsvis 500 og 750 O<br />
min i en fermentor med en diameter på 0,152 m [2], hvor den i dette<br />
projekt anvendte fermentor har en diameter på 0,20 m. De fundne værdier på 0,090 s -1 og<br />
0,278 s -1 passer meget godt med de estimerede værdier. Derfor burde det være muligt at opnå<br />
en højere værdi for KLa med den anvendte fermentor. De muligheder, der er for at øge KLai<br />
fermentoren, er bl.a. at øge omrørerhastigheden hvilket også vil have en positiv effekt på<br />
Pbeluftet<br />
V forholdet. Desuden kan KLapraksis øges ved at ændre udformningen af iltfordeleren, se<br />
Bilag 1.<br />
5.2.2 Sammenligning af forskellige P/V forhold<br />
På Novo Nordisk A/S anvendes fermentorer på 80 m 3 [22], hvorfor det er ikke muligt at<br />
udregne KLa, da der ikke haves en ligning, der gælder for fermentorer på 80 m 3 . Derfor<br />
Pbeluftet<br />
sammenlignes i stedet forholdet, da dette er nemt at beregne.<br />
V<br />
På Novo Nordisk A/S anvendes 80 m 3 fermentorer, som under en fermentering vil være<br />
fyldt op med mellem 60 og 80 m 3 fermenteringsvæske. Herudover vides, at der anvendes en<br />
effekt på 190 kW til at drive omrøreren. Denne værdi vil ikke være den effekt, der reelt<br />
omsættes i fermenteringsvæsken, da der vil være noget friktion, hvorfor det antages at 80 %<br />
af effekten reelt omsættes i væsken:<br />
PNovo = 190 kW = 190000 W<br />
Preel Novo = η⋅PNovo =0,80⋅ 190000 W = 152000 W<br />
VNovo =<br />
60 −80<br />
m<br />
2<br />
3<br />
=70m 3<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 22 af 73
K-PRO 7 Betydningen af ilt og omrøring Gruppe 2<br />
Pbeluftet<br />
Der beregnes et<br />
V forhold for gennemsnitvoluminet: V = 70 m3 , se Tabel 5.2.<br />
Ud fra KLapraktisk erdetmuligtatberegne beluftet P<br />
V<br />
forholdet for MBR fermentoren ved at<br />
anvende ligningen for KLaestimeret, se nedenstående. Der er som nævnt en del usikkerhed på<br />
denne ligning, men det er meget interessant at kunne sammenligne beluftet P<br />
forholdet for den<br />
anvendte fermentor med beluftet P<br />
V<br />
for fermentorerne på Novo Nordisk A/S.<br />
Den lineære hastighed, Vs, i MBR fermentoren er 1,33 ⋅ 10 -2 m<br />
s , se Bilag 1.<br />
0,7<br />
P K a = 0,002⋅ ⋅ V<br />
V <br />
( )<br />
beluftet<br />
L s<br />
0,2<br />
P <br />
−3<br />
7,5 ⋅10<br />
<br />
<br />
beluftet<br />
−2<br />
= 0,002⋅ ⋅( 1,33⋅10 )<br />
Værdier for<br />
Pbeluftet<br />
V<br />
forholdet for den anvendte fermentor i praksis ses i Tabel 5.2.<br />
Derudover beregnes<br />
Pbeluftet<br />
V forholdet ud fra de estimerede værdier af Pbeluftet og det<br />
gennemsnitlige volumen, Vgnst =7,5⋅10 -3 m 3 , se Tabel 5.2.<br />
N<br />
O<br />
min<br />
<br />
P<br />
[W]<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 23 af 73<br />
0,7<br />
V<br />
[m 3 ]<br />
V<br />
Pbeluftet<br />
V<br />
W 3 m <br />
Novo Nordisk A/S - 152000 70 2171<br />
400 1,22 7,5 ⋅ 10 -3<br />
Fermentorestimeret<br />
700 10,26 7,5 ⋅ 10<br />
162<br />
-3<br />
1368<br />
Fermentorpraktisk<br />
N<br />
O<br />
min<br />
<br />
KLa<br />
[s -1 ]<br />
V<br />
[m 3 ]<br />
400 0,0123 7,5 ⋅ 10 -3<br />
700 0,0198 7,5 ⋅ 10 -3<br />
Pbeluftet<br />
V<br />
W 3 m <br />
46<br />
91<br />
Tabel 5.2: P/V forhold for fermentor på Novo Nordisk samt MBR fermentoren.<br />
Pbeluftet<br />
DetsesafTabel5.2,atderfåset<br />
Nordisk A/S, mens det højest opnåelige beluftet<br />
V forhold på 2171 3<br />
m<br />
P<br />
V<br />
P<br />
V<br />
W<br />
0,2<br />
for fermentorerne på Novo<br />
forhold for fermentoren ud fra estimerede<br />
Pbeluftet-værdier er 1368 W<br />
3 . Det højeste m<br />
beluftet forhold er lige godt halvdelen værdien fra Novo<br />
Nordisk A/S. Sammenlignes<br />
Pbeluftet<br />
V<br />
forholdet i praksis med forholdet på Novo<br />
Nordisk A/S ses det, at der ved den anvendte fermentor fås en meget lille værdi i forhold til<br />
Novo Nordisk A/S og i forhold til de estimerede værdier.
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2<br />
6 Forsøgsbeskrivelse<br />
I dette afsnit angives hvordan fermenteringerne blev udført rent praktisk, og hvilke apparater<br />
og metoder der blev anvendt. Fermenteringerne blev udført på Ingeniørhøjskolen Odense<br />
Teknikum i efteråret 2003. Der blev udarbejdet forskellige checklister for at sikre at alle<br />
parametre var indstillet korrekt, inden fermenteringerne blev startet, se Bilag 2.<br />
6.1 Forkultur<br />
Inden fermenteringen var det nødvendigt at fremstille en forkultur. Denne blev podet med S.<br />
cerevisiae fra skråagar udleveret af Novo Nordisk A/S, i en 500 mL Erlenmeyer kolbe<br />
indeholdende 250 mL substrat fremstillet efter opskrift fra Novo Nordisk A/S [21]. Dette blev<br />
gjort for at få gæren ud af dvale samt for at kunne pode fermentoren med en større mængde<br />
end der kunne udtages fra skråagaret. Substratet autoklaveredes og efter ne<strong>dk</strong>øling blev det<br />
podet. Herefter inkuberedes forkulturen ved 32 ºC i ca. to døgn.<br />
6.2 Podning af fermentor<br />
Fermentoren blev podet med et kendt volumen forkultur med en steril fuldpipette vha. en<br />
pipettesuger (Bibby-jet). Efter podning blev der udtaget 30 mL af forkulturen til<br />
trippelbestemmelse af celletørstof, så indholdet af celletørstof i den tilsatte podemængde<br />
kunne udregnes, se Måledata 1 til 6.<br />
6.3 Fermentering<br />
Fermenteringerne foregik i en 16-liters fermentor af typen MBR REACTOR AG.<br />
SWIZERLAND, IMCS 2000, som var udstyret med bl.a. en pH-elektrode, en iltelektrode, et<br />
termometer, et manometer, en prøveudtagningsventil, en trykreguleringsventil samt en<br />
overtryksventil, se Figur 6.1. Fermentoren havde en gennemsnitlig indvendig diameter på<br />
0,20 m og en omrørerdiameter på 0,07 m. Fermentoren blev styret vha. en kontrolenhed samt<br />
reguleringsprogammet VisSim via en PC. Kontrolenheden gjorde det muligt at regulere<br />
temperatur, pH samt omrørerhastighed, mens det vha. PC’en var muligt at styre<br />
substrattilledningen samt opsamle data, se Afsnit 6.4.<br />
Temperaturen og pH-værdien ved fermenteringerne blev valgt i samarbejde med Novo<br />
Nordisk A/S til henholdsvis 30 ºC og 5,4. Herudover er der valgt et fermenteringsforløb på 34<br />
timer.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 24 af 73
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2<br />
Udover online temperatur-, pH- og iltmålinger, måltes indholdet af celletørstof samt<br />
koncentrationen af sukker og ethanol i fermenteringsvæsken, desuden måltes indholdet af<br />
nitrogen og kuldioxid i udgangsgassen. Disse målinger blev foretaget offline, se Afsnit 6.5.<br />
Figur 6.1: MBR REACTOR AG. SWIZERLAND, IMCS 2000<br />
Fermenteringen blev startet som en batchfermentering for at sikre en vis vækst i starten af<br />
forløbet, se Afsnit 7. Denne vækst var anaerob, da sukkerkoncentration i fermentoren ville<br />
være højere end grænsen for Crabtree-effekten, se Afsnit 3.4. Sandsynligvis ville sukkeret<br />
blive nedbrudt først, hvorefter gæren begyndte at nedbryde den dannede mængde ethanol fra<br />
den anaerobe nedbrydning. Ved at måle på indholdet af sukker var det muligt at følge denne<br />
udvikling og derved begynde tilledningen af substrat, når koncentrationen af sukker blev lav.<br />
6.4 Online dataopsamling<br />
Forskellige parameter blev målt online, disse data blev som nævnt opsamlet vha. en PC. Dette<br />
var tilfældet for pH, temperatur og koncentrationen af opløst ilt i fermenteringsvæsken.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 25 af 73
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2<br />
Dataopsamlingen fandt sted vha. reguleringsprogrammet VisSim. Fælles for de forskellige<br />
data var, at PC’en modtog et signal mellem –10 og +10 Volt. Dette signal blev behandlet på<br />
følgende måde, se Figur 6.2.<br />
Figur 6.2: Signal behandling for pH<br />
Til signalet ind blev der lagt 10, således at signalet lå mellem 0 og 20, hvorefter det blev<br />
multipliceret med 0,5; så signalet lå mellem 0 og 10. Dette signal blev multipliceret med en<br />
konstant, der udvidede signalet fra mellem 0 og 10 til det ønskede interval. I tilfældet med pH,<br />
var denne konstant 1,4; således at signalet antog en værdi mellem 0 og 14. Konstanter for<br />
temperatur og ilt, se Tabel 6.1.<br />
Måling af Måle interval Konstant<br />
pH 0 til 14 1,4<br />
Temperatur 0 til 150 °C 15<br />
Ilt 0 til 1000 % 100<br />
Tabel 6.1: Konstanter og måleområde for online parametre.<br />
Temperaturen og pH var værdier, der direkte kunne anvendes som en konkret værdi,<br />
hvorimod værdien for ilt først skulle omregnes, hvilket blev gjort på følgende måde:<br />
- Iltsignalet, som antog en værdi mellem 0 og 1000, multipliceredes med 0,001 således at det<br />
antog en værdi mellem 0 og 1, denne værdi blev kaldt K .<br />
- Derefter blev partialtrykket af O2 ( p ) udregnet som følgende [23]:<br />
O2<br />
= − ⋅<br />
sat<br />
p (P p ) K<br />
O2 total H2O O2<br />
- Herefter omregnedes partialtrykket af O2 til antallet af mg O2, der var opløst pr. L væske,<br />
dette blev gjort ved hjælp af Henrys lov konstant ( K H ) på følgende måde:<br />
mol [ ] [ ]<br />
mg g mg<br />
C O 2(aq) L = K H ⋅p L bar O bar ⋅M <br />
2(g) O ⋅1000<br />
<br />
⋅<br />
2 mol g <br />
Denne værdi var koncentrationen af ilt i rent vand, hvilket ikke var den korrekte værdi, da<br />
der i fermentoren var fermenteringsvæske og ikke rent vand. I dette projekt antages dog, at<br />
værdien for iltkoncentrationen i fermenteringsvæsken ligger lige under iltkoncentrationen i<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 26 af 73<br />
O2
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2<br />
vand, se Afsnit 7.1.3. Anvendte damptryk og Henrys lov konstanter til beregningerne i<br />
temperaturintervallet 25 til 35 ºC, se Tabel 6.2.<br />
Temperatur<br />
T [°C]<br />
Mættet vandamptryk<br />
sat<br />
p [bar]<br />
Henrys lov konstant<br />
HO 2<br />
KH mol Lbar ⋅ <br />
25 3,17 · 10 -2<br />
1,25 · 10 -3<br />
26 3,36 · 10 -2<br />
1,23 · 10 -3<br />
27 3,56 · 10 -2<br />
1,21 · 10 -3<br />
28 3,78 · 10 -2<br />
1,19 · 10 -3<br />
29 4,01 · 10 -2<br />
1,17 · 10 -3<br />
30 4,24 · 10 -2<br />
1,15 · 10 -3<br />
31 4,49 · 10 -2<br />
1,13 · 10 -3<br />
32 4,75 · 10 -2<br />
1,11 · 10 -3<br />
33 5,03 · 10 -2<br />
1,09 · 10 -3<br />
34 5,32 · 10 -2<br />
1,08 · 10 -3<br />
35 5,62 · 10 -2<br />
1,06 · 10 -3<br />
Tabel 6.2: Damptryk og Henrys lov konstant i temperaturintervallet 25 – 35 ºC.<br />
6.5 Prøveudtagning<br />
Prøveudtagningsventilen, se Figur 6.1, blev steriliseret før prøveudtagning ved hjælp af damp,<br />
hvorefter der blev udtaget omkring 10 mL for at fjerne den væske, der sad i<br />
prøveudtagningsventilen. Herefter blev der udtaget ca. 45 mL fermenteringsvæske, som blev<br />
anvendt til tørstof- samt ethanol- og sukkerbestemmelse. Alle manuelt målte data dvs.<br />
absorbans for ethanol og sukker samt volumenmålinger blev indskrevet i Skema for<br />
prøveudtagning, se Bilag 2.<br />
6.5.1 Tørstofbestemmelse<br />
Indholdet af celletørstof i fermentoren blev fundet ved at udtage tre gange 10,00 mL af de 45<br />
mL fra prøveudtagningen, som blev centrifugeret i en centrifuge af typen SIGMA 4 – 10 fra<br />
Stuers ved 3500 O<br />
min i 5 min. Den ovenstående væske blev bortskaffet, mens det<br />
tilbageblivende bundfald tørredes i varmeskab ved 105 ºC i 1 til 2 døgn. Vægten af det tørre<br />
centrifugeglas var kendt, og derved var det muligt efter tørring at bestemme indholdet af<br />
tørstof i de 10,00 mL fermenteringsvæske, hvorefter koncentrationen pr. liter kunne<br />
bestemmes, se Måledata 1 til 6. Der blev foretaget trippelbestemmelse af alle<br />
tørstofbestemmelser.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 27 af 73
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2<br />
Alternativ<br />
Som alternativ til tørstofmålingerne kunne der være foretaget optiske densitet (OD) målinger<br />
til bestemmelse af celletørstof som i Forssling et al. Fordelene ved OD målingerne er at der<br />
opnås et resultat med det samme, hvorimod der ved almindelig tørstofmåling går 1 til 2 døgn,<br />
før resultatet haves. Dette kan bl.a. anvendes, hvis det var besluttet at pode fermenteren med<br />
et fast mængde tørstof og ikke et fast volumen som i dette projekt.<br />
I den indledende fase i dette projekt blev der forsøgt med at foretage OD målinger, disse<br />
blev fortaget vha. spektrofotometer ved 610 nm. Af resultatet sås det, at målingerne på den<br />
samme prøve svingede forholdsvist meget, hvilket de tørstofmålinger der blev fortaget under<br />
dette projekt ikke gjorde, se Måledata 1 til 6. Derudover var det muligt at se en synlig<br />
udvikling af celletørstof i centrifugeglassene fra prøveudtagning til prøveudtagning 5 .<br />
Under dette projekt blev der desuden fortaget målinger af sukker og ethanol, hvilket blev<br />
fortaget vha. spektrofotometer ved 340 nm. Det blev derfor besluttet ikke at måle OD, da det<br />
hurtige resultat ikke var nødvendigt, samt for at undgå at skifte bølgelængde på<br />
spektrofotometeret hver gang der skulle udføres en prøve. Ved skift mellem de to<br />
bølgelængder anvendes forskellige lamper, hvilket medførte, at lamperne jævnligt skulle<br />
slukkes og dermed ikke ville nå at blive stabile.<br />
6.5.2 Sukker- og ethanolbestemmelse<br />
Både sukker og ethanol-koncentrationerne i fermenteringsvæsken blev bestemt ved hjælp af et<br />
enzymkit fra Boehringer Mannheim, hvorefter det var muligt at måle indholdet på et<br />
spektrofotometer af typen UVICON 810 fra KONTRON ANALYTICAL ved 340 nm.<br />
Der blev udtaget en prøve på 10,00 mL af de 45 mL fra prøveudtagningen, som<br />
centrifugeredes i en centrifuge af typen SIGMA 4 – 10 fra Stuers ved 3500 O<br />
min i5min.<br />
Herefter placeredes prøven i et 80 ºC vandbad for at standse de enzymatiske reaktioner i<br />
væsken. Herefter blev der udtaget 0,100 mL prøve til hver af de to bestemmelser, som blev<br />
behandlet efter forskrifterne, se Bilag 3 og Bilag 4. Der blev kun foretaget en gentagelse, da<br />
enzymkittene var kostbare, samtidig var det vigtigere at få et billede af udviklingen i<br />
indholdet af ethanol og sukker end at få de specifikke koncentrationer.<br />
Kendte og beregnede koncentrationer af henholdsvis sukker og ethanol blev sammenlignet for<br />
at undersøge, hvor anvendelige enzymkittene var, se Bilag 3 og Bilag 4.<br />
5 Denne udvikling kunne kun ses, men ikke måles.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 28 af 73
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2<br />
6.5.3 Gasanalyse<br />
Til fermentoren var der tilkoblet en gasmus, som er et glasrør med<br />
to ventiler, en i hver ende samt et septum til udtag af gasprøver.<br />
Gasmusen anvendes til at opsamle udgangsgas fra fermentoren, se<br />
Figur 6.3. For at udtage en prøve blev begge ventiler i musen åbnet<br />
og udgangsgassen løb igennem, herefter blev den nederste ventil<br />
lukket og efter nogle sekunder den øverste ventil, således at prøven<br />
var ved 1 atm., og derfor kunne sammenlignes med<br />
standar<strong>dk</strong>urverne, se Bilag 5. Herved var der opsamlet gas i musen,<br />
og der kunne nu udtages en prøve på 50 µL med en gassprøjte,<br />
hvorefter denne analyseredes ved gaschromatografi, se Bilag 5.<br />
Udgangsgassen<br />
Figur 6.3: Gasmus.<br />
analyseredes for nitrogen og kuldioxid, idet koncentrationerne kunne findes ud fra<br />
udarbejdede standar<strong>dk</strong>urver for de to gasser. Herefter kan koncentrationen af ilt i<br />
udgangsgassen beregnes og derefter kan respirationskoefficienten vurderes. Standar<strong>dk</strong>urverne<br />
for nitrogen og kuldioxid er desuden undersøgt statistisk, se Bilag 5. For nærmere beskrivelse<br />
af anvendt statistik, se Bilag 6. Der blev foretaget trippelbestemmelse af udgangsgassen.<br />
6.5.4 Pladeudspredning<br />
Det var meget vigtigt, at fermenteringerne foregik under sterile forhold, og at kun S.<br />
cerevisiae var tilstede i fermentoren. Derfor blev der foretaget pladeudspredning af gæren<br />
efter hver fermentering, således at eventuel kontaminering kunne opdages. Der blev foretaget<br />
dobbeltbestemmelse i tilfælde af at petriskålen blev kontamineret på anden vis.<br />
Pladeudspredningen blev foretaget ved overfladeudsåning på Yeast-Peptone-Glucose (YPG)<br />
agar ud fra nedenstående opskrift [5]:<br />
Yeast-Peptone-Glucose agar<br />
- 24 g<br />
L Cell Count Agar<br />
- 5 g<br />
L peptone<br />
- 20 g<br />
L gærekstrakt<br />
- 10 g<br />
L D-glucose<br />
- 1,00 g<br />
L KH2PO4<br />
- 0,50 g<br />
L MgSO4 ⋅ 7H2O<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 29 af 73
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2<br />
Der blev fremstillet 500 mL YGP- agar i en 500 mL målekolbe. Derefter blev der foretaget<br />
en opblødning af ingredienserne i koldt vand i omkring 15 min for at minimere risikoen for at<br />
den ydre cellemembran svulmede op og dermed kunne give et grynet substrat, hvilket ofte<br />
skete ved brug af varmt vand 14]. Til sidst justeredes pH til 5,4 vha. saltsyre. Herefter blev<br />
blandingen opvarmet til kogning, indtil alle partikler var opløst, hvorefter substratet blev<br />
autoklaveret ved 121 ºC i 20 min, se Afsnit 6.9. Agaren blev kølet til omkring 50 ºC, inden<br />
den blev overført til petriskålene for at undgå kondensdannelse i petriskålene ved ne<strong>dk</strong>øling<br />
til stuetemperatur. Petriskålene blev fyldt i en LAF-sterilbænk for at sikre sterile betingelser.<br />
Herefter tørredes petriskålene i sterilbænken, hvorefter de blev sat på køl indtil anvendelse.<br />
Efter pladeudspredning inkuberedes petriskålene ved 32 ºC i ca. to døgn [5].<br />
6.6 Tilledning til fermentoren<br />
Substrat, ammoniakvand, saltsyre og skumdæmper blev tilledt til fermentoren vha.<br />
slangepumper, se Figur 6.4b). Flaskerne til substrat, ammoniakvand og saltsyre var bluecap<br />
flasker forbundet med en slange op til fermentoren. Slangepumpen der blev anvendt til dette<br />
styres automatisk af PC og kontrolenhed, se Figur 6.4b) nederst. Skumdæmperen blev tilledt<br />
en slangepumpe, se Figur 6.4b) øverst, denne blev styret manuelt. På bluecap flaskernes låg<br />
var der monteret et luftindtag for at undgå undertryk i flaskerne, et sterilfilter for at undgå<br />
kontaminering samt en slange til at lede væsken over til fermentoren, se Figur 6.4a).<br />
a) Bluecap flaske. b) Slangepumper<br />
Figur 6.4: Flaske og slangepumper til tilledning.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 30 af 73
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2<br />
6.6.1 Substratforbrug<br />
Substratet blev fremstillet ud fra en opskrift fra Novo Nordisk A/S [23], herefter blev pH<br />
justeret til 5,4. Der blev til hver fermentering fremstillet 10 L substrat til tilledning, som blev<br />
autoklaveret umiddelbart efter fremstilling, se Afsnit 6.9, og 3,5 L startsubstrat, der blev<br />
autoklaveret i fermentoren umiddelbart inden podning.<br />
Hastigheden, hvormed substratet blev tilledt, styredes af en PC. Substratet blev tilledt med<br />
en pumpe, som modtog et signal fra PC’en mellem 0 og 5 V. Under fermenteringerne blev der<br />
anvendt indstillinger i intervallet 0 til 1 V. Pumpen drejede ikke rundt, før den modtog et<br />
signal der var større end eller lig 0,1 V. Dvs. at modtog pumpen et signal eksempelvis på 0,05<br />
V; blev der ikke tilledt noget substrat.<br />
Substratforbruget blev målt manuelt på flasken ved hver prøveudtagning samt før og efter<br />
fermenteringen, se Bilag 7.<br />
6.6.2 Skumdæmpning<br />
For at mindske skumdannelse under fermenteringerne blev der tilsat skumdæmper. Denne<br />
tilsætning blev foretaget manuelt, når skumniveauet blev for højt. Tilsætningen blev foretaget<br />
vha. af en slangepumpe, se Figur 6.4b) øverst.<br />
6.6.3 pH<br />
Der blev foretaget online pH-målinger, og ved ændringer i pH var fermentoren tilkoblet en<br />
kontrolenhed, som justerede pH ved tilledning af enten 10 % ammoniakvand eller 2 M<br />
saltsyre [22].<br />
Forbruget af ammoniakvand og saltsyre blev målt manuelt ved hver prøveudtagning samt<br />
ved opstart og efter endt fermentering, se Bilag 7. Derudover kalibreredes pH-elektroden før<br />
hver fermentering for at sikre korrekte målinger.<br />
6.7 Temperatur<br />
Temperaturen blev målt online som pH, og kontrolenheden sørgede for opvarmning eller<br />
køling af fermentoren vha. henholdsvis damp eller koldt vand i kappen.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 31 af 73
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2<br />
6.8 Ilt<br />
Da nedbrydningen af sukker gerne skulle forløbe under så aerobe forhold, som det var<br />
praktisk muligt, se Afsnit 3.3, blev iltindholdet i fermenteringsvæsken målt online. Hermed<br />
var det muligt at følge iltindholdet under fermenteringen. Luftflowet gennem fermentoren<br />
blev sat til 25 L<br />
min . Luften til fermentoren blev leveret af en kompressor og passerede først<br />
gennem et oliefilter og derefter et sterilfilter. Oliefilteret havde til formål at undgå tilstopning<br />
af sterilfilteret, mens sterilfilteret skulle sikre mod kontaminering af fermentoren.<br />
Iltelektroden blev kalibreret inden opstart ved at tilsætte natriumsulfid til vand i<br />
fermentoren for at finde nulpunktet for iltkoncentrationen i vand, idet natriumsulfid forbruger<br />
ilten i vand. Herefter blev vandet gennemboblet med luft i ca. en time under antagelsen af at<br />
væsken hermed var mættet med ilt. For teori om ilt, se Afsnit 5.<br />
6.9 Autoklavering<br />
Substratet blev autoklaveret ved 121 ºC i 20 min i begyndelsen af projektperioden, men dette<br />
viste sig at være for høj en varmemængde, da der forekom Maillard reaktion 6 , hvorved<br />
substratet blev sort. Herefter blev autoklaveringstiden og -temperaturen sat ned til 10 min ved<br />
110 ºC. Derudover blev det observeret, at hvis substratet blev opbevaret i køleskab inden<br />
autoklavering var der sket en u<strong>dk</strong>rystallisation ved ne<strong>dk</strong>ølingen, hvorfor der forekom Maillard<br />
reaktion ved autoklavering. Derfor blev substratet autoklaveret umiddelbart efter<br />
autoklavering. Skumdæmper og saltsyre samt sterilfilter, tildrypningsnåle og pipetter blev<br />
autoklaveret ved 121 ºC i 20 min. Ammoniakvandet blev ikke autoklaveret, da dette ville give<br />
store lugtgener i laboratoriet, og blev i stedet sterilfiltereret. Dette foregik ved vakuumsug<br />
gennem et sterilfilter.<br />
6<br />
Ikke enzymatisk brunfarvning hvor sukkerstoffer og aminosyrer eller proteiner reagerer.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 32 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7 Fermenteringerne<br />
Fermenteringerne foregik i en MBR fermentor, der bl.a. var<br />
udstyret med en omrører. Omrøreren bestod af en akse med to<br />
omrørerblade påsat, se Figur 7.1. For at opnå omrøring i<br />
fermentoren var det nødvendigt, at væskestanden nåede over den<br />
nederste omrører. Det volumen, der dækker den nederste omrører,<br />
var ca. 3,5 L. Derfor var startvolumen af substrat sat til 3,5 L.<br />
I Forssling et al. var de 3,5 L startsubstrat ikke tilsat sukker,<br />
hvilket betød, at tilledningen af ekstra substrat skulle startes straks,<br />
således at gæren havde noget næring at vokse af. En lille mængde<br />
gær kunne kun omsætte en lille mængde sukker, hvilket bevirkede,<br />
at tilledningen skulle være meget langsom. I praksis kunne substratpumpen<br />
ikke pumpe så langsomt. Pumpen modtog et signal fra en<br />
PC. Signalet for at tillede så langsomt, at en inhibering pga.<br />
sukkerkoncentrationen blev undgået, var så lille, at det af pumpen<br />
opfattes som 0, se Afsnit 6.6. Figur 7.1: Omrøreren.<br />
I Forssling et al. resulterede dette i en af to ting. Enten at pumpen ikke kunne tillede<br />
substrat, før signalet blev tilstrækkeligt stort. Dette fandt først sted efter ca.12 timer og betød,<br />
at gæren blev sultet og der ikke har været vækst i denne tid, dvs. en forlænget nølefase. Eller<br />
også blev substrat tilledningen startet på et højere niveau, således at gæren ikke havde den<br />
forlængede nølefase. I begge tilfælde blev der forholdsvis hurtigt tilledt en mængde sukker til<br />
en lille mængde gær, hvilket sandsynligvis gav en høj sukker koncentration, og dermed<br />
virkede inhiberende, se Afsnit 3.4 og 3.5.<br />
I dette projekt blev der i stedet foretaget en batchfermentering i de 3,5 L startsubstrat. I de<br />
3,5 L substrat var der tilsat en mængde sukker, således den mængde gær, der blev podet med,<br />
kunne opformeres, inden tilledningen af substrat blev startes. Meningen var at opnå så stor en<br />
mængde gær, så gæren kunne nå at forbruge den mængde sukker der blev tilledt, således at<br />
sukkeret ikke virkede inhiberende.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 33 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
I batchfermenteringen ville der være en inhiberende effekt pga. sukkerkoncentrationen.<br />
Tilledningen af substrat blev først startet, når sukkerkoncentrationen nåede under et<br />
inhiberende niveau, se Afsnit 3.4, således at sukkeret kun havde en inhiberende effekt i<br />
batchfasen i starten af fermenteringen, og at der under den resterende del, fed<br />
batchfermentering, ikke ville være inhibering i særlig udtalt grad.<br />
7.1 Fermentering 1<br />
Formålet med fermentering 1 (f1) var at få noget erfaring med kørsel af fermentoren samt de<br />
forskellige analyser, der skulle udføres under dette projekt.<br />
7.1.1 Startbetingelser f1<br />
Det substrat, der bliver anvendt til fermentering på Novo Nordisk A/S, har en<br />
sukkerkoncentration på 145 g<br />
L . Det blev derfor valgt at anvende samme koncentration i de 3,5<br />
L substrat, batchfermenteringen skulle foregå i.<br />
Herudover blev der valgt en pH-værdi på 5,4 og en temperatur på 30 °C, se Afsnit 6.3.<br />
Desuden blev der anvendt en podemængde på 100 mL og en omrørerhastighed på 400 O<br />
min .<br />
Måledata og resultater fra fermenteringen ses i Måledata 1, og de vigtigste elementer<br />
diskuteres i nedenstående.<br />
7.1.2 pH og temperatur f1<br />
Det ses af Figur 7.2, at reguleringen kunne opretholde et stabilt pH- og temperaturniveau. pH<br />
elektroden var svær at kalibrere, pga. en løs forbindelse, så om pH-værdien var 5,3 eller eks.<br />
5,4; vides ikke med sikkerhed. Da der ikke blev optimeret på pH i dette projekt var det ikke<br />
vigtigt at opretholde en præcis pH-værdi, men at den blev holdt konstant. Det ses af Figur 7.2<br />
at pH-værdien var stabil på 5,4 ± 0,1, hvilket var tilfredsstillende 7 ,samtattemperaturenlå<br />
indenfor 30 °C ± 1,5, hvilket også var tilfredsstillende 8 .<br />
7 Et tilfredsstillende pH interval var ± 0,5 i perioder under 30 min. og ± 0,3 i længere perioder.<br />
8 En tilfredsstillende temperatur interval var ± 5 °C i perioder under 30 min. og ± 2 ºC i længere perioder.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 34 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
5,6<br />
5,5<br />
5,4<br />
5,3<br />
5,2<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
7.1.3 Ilt f1<br />
Tid [timer]<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 35 af 73<br />
34<br />
33<br />
32<br />
31<br />
30<br />
29<br />
28<br />
27<br />
26<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid[timer]<br />
a) pH f1. b) Temperatur f1.<br />
Figur 7.2: pH og temperaturforløb under f1.<br />
Opløseligheden af ilt i vand ved 30 °C og 1 atm. var 7,79 mg<br />
L<br />
1 er opnået følgende måledata:<br />
Ilt [mg/L]<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
-1<br />
, se Afsnit 5.1. Fra fermentering<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.3: Iltforløb under f1.<br />
Det ses af Figur 7.3, at der i de første ca. 10 timer var der rigeligt ilt tilstede i væsken, og at<br />
iltindholdet lå omkring 7-7,5 mg<br />
L<br />
. Denne værdi er lidt under den teoretiske værdi på 7,79 mg<br />
L ,<br />
hvilket kan skyldes at den teoretiske værdi er ilts opløselighed i rent vand, og at en<br />
fermenteringsvæske har fysiske egenskaber forskellige fra vands. Derfor antages, at<br />
opløseligheden af ilt i fermenteringsvæsken ikke er den samme som opløseligheden af ilt i<br />
vand, men at opløseligheden af ilt i fermenteringsvæsken ligger lidt under opløseligheden af<br />
ilt i vand. Det antages derfor, at fermenteringsvæsken var mættet med ilt i de første 10 timer.
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
Herefter blev ilten rimeligt hurtigt forbrugt og efter 12 til 13 timer var iltindholdet i<br />
væsken nået 0 mg<br />
L<br />
, hvilket betød, at gæren brugte ilten ligeså hurtigt, som den blev opløst i<br />
væsken, og dermed var ilttilførslen ikke tilstrækkelig. Dette medfører at sukkeret omdannes<br />
anaerobt.<br />
I Forssling et al. er dette problem ikke omtalt, tværtimod blev det antaget, at iltindholdet i<br />
væsken var tilstrækkelig. Det vælges derfor at se nærmere på disse resultater.<br />
7.1.4 Værdier fra Forssling et al.<br />
Fra Forssling et al. ses der på online iltmålinger fra fermentering 9, hvor måledataene ses i<br />
Figur 7.4a) i mmHg, og hvor dataene er omregnet i Figur 7.4b) til mg<br />
L .<br />
475<br />
425<br />
375<br />
325<br />
275<br />
225<br />
175<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Omregningen fra mmHg til mg<br />
L<br />
8<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
a) Ilt [mmHg]. b) Ilt [mg/L].<br />
Figur 7.4: Ilt under fermentering 9, fra Forssling et al..<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 36 af 73<br />
20<br />
18<br />
16<br />
14<br />
12<br />
10<br />
i Figur 7.4 er foretaget ved brug af følgende formler:<br />
[ ]<br />
[ ]<br />
p mmHg<br />
O2<br />
pO bar = 1,01325bar⋅ 2<br />
760 mmHg<br />
[ ]<br />
mg mol<br />
g mg<br />
C O 2(aq) K L H p L bar O bar M <br />
2 O 1000 <br />
<br />
= ⋅ ⋅ ⋅<br />
⋅ <br />
2 mol g <br />
Det ses, at der i Forssling et al. har været en iltkoncentration på op til 20 mg<br />
L<br />
. Fermenteringen<br />
foregik ved en temperatur på 33 °C, hvilket betyder, at den teoretiske opløselighed er på 7,41<br />
mg<br />
L<br />
. Det ser ud som om, iltmålingerne ikke har været præcise nok under forsøg udført af<br />
Forssling et al. Desuden vides, at iltelektroden ikke var kalibreret, og at det ikke var det<br />
præcise iltindhold, der var interessant for Forssling et al., men blot om der var ilt tilstede i<br />
væsken eller ej.
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
Hvis iltkurven fra fermentering 9 i Forssling et al. forskydes, således at toppunktet passer<br />
med opløseligheden ved de 33 °C, fås følgende kurve, se Figur 7.5a).<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
-1<br />
-2<br />
-3<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 37 af 73<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
-1<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
a) Forskudt ilt kurve fra Forssling et al. b) Ilt kurve fra f1.<br />
Figur 7.5: Sammenligning af forskudt iltkurve fra Forssling et al. med iltkurve fra f1.<br />
Det ses af Figur 7.5a), at kurven fra Forssling et al. i forløb minder om kurven fra<br />
fermentering 1, se Figur 7.5b). Det ses desuden, at der efter 10 til 15 timer på begge kurver<br />
ikke var mere ilt tilstede i fermenteringsvæsken.<br />
Dog kan værdierne fra Figur 7.5a) ikke direkte anvendes, da iltelektroden som før nævnt<br />
ikke var kalibreret, og dermed var hældningen på kalibreringskurven ikke den korrekte. Det<br />
kunne derfor tænkes, at værdierne fra Figur 7.5a), der ligger under nulpunktet, skulle ligge<br />
omkring 0 mg<br />
L .<br />
7.1.5 Sukkerkoncentration f1<br />
Til måling af sukkerkoncentrationen blev der anvendt et enzymkit og efterfølgende analyse på<br />
et spektrofotometer. Her måltes en glucosekoncentration, som så blev omregnet til en<br />
sukkerkoncentration.<br />
Da der fra starten af fermenteringer var en sukkerkoncentration på 145 g<br />
L , se Afsnit 7.1.1<br />
og der under f1 kun er blevet målt en sukkerkoncentration omkring 7 g<br />
L , se Måledata 1,<br />
vurderes det, at målingerne fra f1 er ikke sikre nok. Da den rigtige sukkerkoncentration ikke<br />
kunne findes, blev det besluttet at stoppe målingerne for at spare på enzymkittene, da disse<br />
var rimelig kostbare. Det var forventet at sukkerkoncentrationen var høj under f1, da<br />
startkoncentrationen var 145 g<br />
L , hvilket har virket inhiberende. Derfor blev det besluttet ikke<br />
at tillede substrat under fermentering 1.
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.1.6 Ethanolkoncentration f1<br />
Pga. den høje sukkerkoncentration, der gav en inhiberende virkning, blev der dannet en del<br />
ethanol. Da den dannede ethanol formentlig var i en rimelig høj koncentration, gav denne de<br />
samme problemer ved ethanolmålingerne, som sukkeret gav ved sukkermålingerne. Af<br />
samme årsager blev det ligeledes besluttet at stoppe målingen af ethanol.<br />
7.1.7 Deldiskussion 1<br />
Det blev pga. den høje sukkerkoncentrationen valgt at sænke startkoncentrationen en faktor<br />
10 til 14,5 g<br />
L . Denne lavere koncentration vil ikke kunne inhibere cellevæksten i nær samme<br />
grad.<br />
7.2 Fermentering 2<br />
Formålet med fermentering 2 (f2) var at få nogle bedre målinger for sukker og ethanol<br />
koncentrationen.<br />
7.2.1 Startbetingelser f2<br />
Substratet til batchfermenteringen til f2 havde en sukkerkoncentration på 14,5 g<br />
L . Desuden<br />
blev der anvendt en podemængde på 100 mL og en omrørerhastighed på 400 O<br />
min .Øvrige<br />
betingelser, se Afsnit 6.3. Måledata og resultater fra fermenteringen ses i Måledata 2 og de<br />
vigtigste elementer diskuteres i nedenstående.<br />
7.2.2 pH og temperatur f2<br />
pH og temperaturen lå under hele f2 på et stabilt og tilfredsstillende niveau, se Måledata 2,<br />
uden de store udsving. Dog var der omkring 15. til 17. time et fald i pH-værdien. Dette<br />
skyldtes, at der under fermenteringen dannedes forsurende produkter og at pumpen til<br />
tilledning af ammoniakvand satte ud, hvilket blev udbedret. Som det ses i Måledata 2, faldt<br />
pH fra 5,4 til 4,8, altså et fald på 0,6, hvilket er tæt på det tilfredsstillende interval på ± 0,5.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 38 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.2.3 Substrattilledning f2<br />
Der blev under f2 besluttet at starte for substrattilledningen efter ca. 10 timer, se Figur 7.6,<br />
hvorefter der blev besluttet at skrue op for tilledningen efter 15 timer og igen efter 20 timer.<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 39 af 73<br />
8000<br />
6000<br />
4000<br />
2000<br />
Tid [timer]<br />
a) Pumpesignal til substratpumpe under f2. b) Volumen substrat tilledt under f2.<br />
Figur 7.6: Substrattilledning under f2<br />
Det ses af Figur 7.6, at substrattilledningen foregik i 3 trin.<br />
7.2.4 Sukker- og ethanolkoncentration f2<br />
Sukker- og ethanolkoncentrationerne for f2 ses af Figur 7.7. Her ses det, at<br />
sukkerkoncentrationen havde et vist niveau, hvorefter den hen imod 10 timer begyndte at<br />
falde, hvorefter den igen steg. Endnu et svagt fald efterfulgt af en stigning blev der observeret<br />
efter ca. 16 timer. Stigningen i koncentrationen kom efter, at der blev skruet op for substrattilledningen<br />
og dermed også for tilledningen af sukker.<br />
Koncentration [g/L]<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.7: Sukker- og ethanolkoncentrationen under f2.<br />
Ethanol<br />
Sukker
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
Ethanol koncentrationen var nær nul i starten af fermenteringen og steg derefter dramatisk<br />
efter ca. 20 timer til et niveau over 60 g<br />
L . Udover dette kendes den nøjagtige koncentration af<br />
ethanol ikke, se Bilag 4.<br />
Stigningen i ethanolkoncentrationen kunne skyldes, at ilttilgængeligheden ikke var<br />
tilstrækkelig, og der dermed dannedes ethanol under de anaerobe forhold. Samtidig blev den<br />
dannede ethanol ikke nedbrudt, da der ikke var nok ilt til denne omdannelse, se Afsnit 3.4.<br />
7.2.5 Ilt f2<br />
Ilt [mg/L]<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.8: Ilt koncentrationen under f2<br />
Det ses af Figur 7.8, at der i starten af fermenteringen var rigeligt ilt tilstede i væsken, og at<br />
koncentrationen lå omkring mætning. Efter 5 til 7 timer faldt koncentrationen af opløst ilt i<br />
væsken, hvilket tydede på at nølefasen for gæren var ovre, og at den eksponentielle fase var<br />
påbegyndt. Ilten faldt til nulpunktet, hvorefter der blev observeret en svag stigning. På Figur<br />
7.8 ses det, at der indtrådte tre stigninger i iltkoncentrationen, henholdsvis efter 10, 14 og 20<br />
timer. Disse stigninger i iltkoncentrationen tydede på inhibering, hvor gærens væksthastighed<br />
blev sænket, hvorefter ilten blev opløst i væsken hurtigere end den blev forbrugt af gæren, se<br />
Figur 7.8. Dette passede med, at der blev skruet op for substrat tilledningen tre gange, se<br />
Figur 7.6. Herved blev sukkerkoncentrationen øget og dermed også den inhiberende effekt, se<br />
Afsnit 3.4.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 40 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.2.6 Deldiskussion 2<br />
Fermentering 2 forløb forholdsvis godt, derfor blev det besluttet at udføre en fermentering<br />
under de samme betingelser som under f2.<br />
7.3 Fermentering 3<br />
Formålet med fermentering 3 (f3) var at gentage f2.<br />
7.3.1 Startbetingelser f3<br />
Startbetingelserne for f3 var de samme som f2, se Afsnit 7.2.1. Måledataene og resultaterne<br />
for fermenteringen ses i Måledata 3 og de vigtigste elementer diskuteres i nedenstående.<br />
7.3.2 Temperatur f3<br />
Temperaturforløbet under f3 så ud som følgende, se Figur 7.9.<br />
Temperatur [°C]<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.9: Temperaturforløb under f3.<br />
Det ses, at temperaturen lå omkring 30 °C det meste af fermenteringen, hvilket var<br />
tilfredsstillende, dog var temperaturen oppe omkring 50 °C, i de første ca. 10 min., hvilket<br />
formentlig chokerede gæren, og dermed betød en forlænget nølefase.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 41 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.3.3 Ilt f3<br />
Ilt koncentrationen forløb som følgende under f3, se Figur 7.10<br />
Ilt [mg/L]<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.10: Iltkoncentration under f3.<br />
Det ses af Figur 7.10, at der under f3 var rigeligt ilt tilstede i væsken fra starten, og at ilten<br />
lå omkring mætning indtil efter ca. 20 til 25 timer. Herefter faldt koncentrationen af ilt opløst<br />
i væsken. Den lange nølefase inden gæren for alvor begyndte at bruge ilten, stemmer overens<br />
med den forventede lange nølefase pga. den forhøjede temperatur i starten af fermenteringen,<br />
se Figur 7.9. Dog så det ud til, at alt ilten i væsken blev forbrugt, da væksten af gæren kom i<br />
gang.<br />
7.3.4 Deldiskussion 3<br />
Der kom ikke det store ud af f3, men der var dog elementer der kunne bruges. Der var ikke<br />
nok ilt opløst i væsken under f3 efter væksten kom i gang. Dette var også tilfældet ved både<br />
f1 og f2. Det kunne godt se ud, som om ilten var en begrænsede faktor. Derfor vil det ved den<br />
kommende fermentering f4 blive forsøgt at øge iltkoncentrationen i væsken.<br />
Under fermenteringen på Novo Nordisk A/S anvendes et overtryk på ca. 0,5 bar. Dette<br />
gøres for at undgå kontaminering. Ud over denne effekt øger et overtryk også opløseligheden<br />
af ilt i væsken, se Afsnit 5.1. Derfor besluttes det at øge trykket under f4 med ca. 0,5 bar. For<br />
yderligere at forbedre iltoverførslen hæves omrørerhastigheden fra 400 O<br />
min<br />
til 700 O<br />
min .<br />
Herudover ønskes det at gøre nølefasen kortere, således at væksten hurtigere kommer i<br />
gang, så der i sidste ende opnås et større udbytte. Det besluttes derfor, at podemængden<br />
fordobles fra 100 mL til 200 mL, så der fra start er en større mængde gær til at omsætte<br />
sukkeret. Dermed skulle koncentrationen hurtigere komme under et niveau således at<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 42 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
Crabtree-effekten undgås. Af samme årsag besluttes det endnu en gang at reducere<br />
sukkerkoncentrationen i startsubstratet. Det besluttes at halvere koncentrationen fra 14,5 g<br />
L til<br />
7,25 g<br />
L .<br />
7.4 Fermentering 4<br />
Formålet med fermentering 4 (f4) var at opnå en højere iltkoncentration i væsken.<br />
7.4.1 Startbetingelser f4<br />
Substratet til batchfermenteringen under til f4 havde en sukkerkoncentration på 7,25 g<br />
L .<br />
Desuden blev der anvendt en podemængde på 200 mL, en omrørerhastighed på 700 O<br />
min samt<br />
sat et overtryk på fermentoren på 0,5 bar. Øvrige betingelser, se Afsnit 6.3.<br />
Måledataene og resultaterne fra fermenteringen ses i Måledata 4, og de vigtigste elementer<br />
diskuteres i nedenstående.<br />
7.4.2 pH og temperatur f4<br />
pH og temperaturen under f4 lå på et stabilt niveau på nær et par udsving, se Figur 7.11.<br />
5,8<br />
5,4<br />
5,0<br />
4,6<br />
4,2<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
35<br />
34<br />
33<br />
32<br />
31<br />
30<br />
29<br />
28<br />
27<br />
26<br />
25<br />
0 5 10 15 2 0 2 5 3 0 3 5<br />
Tid [timer]<br />
a) pH-forløb under f4. b) Temperaturforløb under f4.<br />
Figur 7.11: pH- og temperaturforløb under f4.<br />
Det ses af Figur 7.11, at pH og temperaturen holdte sig på et stabilt niveau under f4 på nær<br />
et udsving i pH efter 30 timer og et udsving i temperatur efter 15 timer. Disse udsving skyldes<br />
tryksvingninger undervejs i fermenteringen, hvilket beskrives i næste afsnit.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 43 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.4.3 Ilt f4<br />
Ilt [mg/L]<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.12: Iltkoncentrationen under f4.<br />
Det ses af Figur 7.12, at iltkoncentrationen lå lige over 11 mg<br />
L<br />
de første 15 timer, hvilket<br />
stemmer overens med opløseligheden for ilt ved 0,5 bars overtryk på 11,64 mg<br />
L ,seAfsnit5.1.<br />
Efter ca. 15 timer faldt iltkoncentrationen fra lidt over 11 mg<br />
L<br />
til lidt over 7 mg<br />
L<br />
, hvilket passer<br />
med opløseligheden af ilt i vand ved atmosfæretryk. Dette skyldes, at der efter 15 timer skulle<br />
startes for substrattilledningen. Substratpumpen kunne ikke levere et tryk, der var stort nok til<br />
at overføre substrat til fermentoren ved et overtryk på 0,5 bar. Derfor blev trykket manuelt<br />
taget af fermentoren, således at substrattilledningen kunne startes, og fermenteringen forsatte<br />
herefter ved atmosfære tryk.<br />
Den overnævnte trykændring fandt sted efter 15 timer, hvorefter der også var et udslag i<br />
temperaturen, se Figur 7.11b), hvilket skyldes trykændringen.<br />
Fermenteringen forsatte normalt indtil 30. time, hvor iltkoncentrationen pludselig steg.<br />
Dette skyldes, at fermenteringen begyndte at skumme og ved ca. 30 timer skummede<br />
fermentoren over, hvilket medførte at alle ventiler stoppede til. Dette bevirkede en<br />
øjeblikkelig trykstigning til ca. 1 bars overtryk, hvormed opløseligheden af ilt steg. Der blev<br />
nu tilført mere ilt til væsken end gæren kunne nå at bruge.<br />
Den ovennævnte trykstigning, som fandt sted efter 30 timer, bevirkede at pumperne ikke<br />
var i stand til at tilføre hverken substrat eller saltsyre og ammoniakvand til at regulere pH. Da<br />
der ved fermentering dannedes forsurende produkter, faldt pH, når der ikke løbende blev<br />
tilledt base. Det var den pH ændring, der blev observeret efter ca. 30 timer, se Figur 7.11a).<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 44 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
Efter ca. 30 timer blev der tilledt noget skumdæmper, og trykket blev igen manuelt taget af<br />
fermentoren. Iltkoncentrationen faldt, og pH-reguleringen forsatte. Herefter kendes ikke det<br />
eksakte volumen af væske i fermentoren, da noget af væsken var presset ud gennem ventiler<br />
mm. Desuden kunne pumperne ikke pumpe mod det store overtryk, hvilket medførte at noget<br />
af væsken i fermentoren blev presset fra fermentoren og over i beholderne til både substrat-,<br />
ammoniakvand- og saltsyretilledning. Dette var tilfældet for ca. halvdelen af væsken i<br />
fermentoren.<br />
7.4.4 Deldiskussion 4<br />
Under fermentering 4 lykkedes det ikke at hæve trykket i fermentoren, så der kunne opløses<br />
mere ilt i væsken. Dog ses det af Figur 7.12 efter 30 timer, at hvis trykket og dermed<br />
opløseligheden af ilt steg, kunne der tilføres mere ilt til væsken, således at ilt ikke længere var<br />
den begrænsende faktor.<br />
Efter f4 blev der forsøgt at tillede substrat til fermentoren ved forskellige overtryk, hvor<br />
det lykkedes at tillede substrat ved et overtryk på 0,2 bar, således at tilledningen også var<br />
forholdsvis stabil. Det besluttes derfor at udføre næste fermentering f5 med et overtryk på 0,2<br />
bar.<br />
7.5 Fermentering 5<br />
Formålet med fermentering 5 (f5) var at udføre en fermentering under et moderat overtryk.<br />
7.5.1 Startbetingelser f5<br />
Substratet til batchfermenteringen under til f5 havde en sukkerkoncentration på 7,25 g<br />
L .<br />
Desuden blev der anvendt en podemængde på 200 mL og en omrørerhastighed på 700 O<br />
min<br />
samt sat et overtryk på fermentoren på 0,2 bar. Øvrige betingelser, se Afsnit 6.3. Måledataene<br />
og resultaterne fra fermenteringen ses i Måledata 5, og de vigtigste elementer diskuteres i<br />
nedenstående.<br />
7.5.2 pH og temperatur f5<br />
pH og temperaturen blev holdt på et stabilt niveau. pH på 5,4 ± 0,05 og temperaturen på 30<br />
°C ± 1 °C, hvilket er tilfredsstillende, se Måledata 5.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 45 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.5.3 Ilt f5<br />
Det ses af Figur 7.13, at iltkoncentrationen de første 10 timer lå omkring 9 mg<br />
L<br />
, hvilket passer<br />
med opløseligheden på 9,33 mg<br />
L ved 0,2 bars overtryk. Efter 10 timer begyndte mængden af<br />
opløst ilt at falde, hvilket indikerede at nølefasen var forbi. Efter ca. 15 timer forekom der et<br />
hak i kurven, som svarede til at der på dette tidspunkt blev startet for substrattilledningen, og<br />
dermed steg sukkerkoncentrationen, hvilket havde en inhiberende virkning, se Afsnit 3.4.<br />
På Figur 7.13 ses, at iltkoncentrationen først nærmede sig nul efter 25 til 27 timer.<br />
Sammenlignes dette med ilten i f2, ses det af Figur 7.8, at iltkoncentrationen faldt hurtigere<br />
ved f2. Dette kan både skyldes, at ilttilførslen var bedre under f5 end under f2, da<br />
omrørerhastigheden var sat op, og at der kunne opløses mere ilt i væsken pga. det svage<br />
overtryk på 0,2 bar.<br />
Ilt [mg/L]<br />
10<br />
9<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [tim e r]<br />
Figur 7.13: Iltkoncentrationen under f5.<br />
7.5.4 Sukker- og ethanolkoncentration f5<br />
På Figur 7.14 ses, at koncentrationerne af både sukker og ethanol var lave de første ca. 15<br />
timer. Herefter blev substrattilledningen startet, hvilket bevirkede, at koncentrationen af<br />
sukker steg. Stigning i sukkerkoncentrationen medførte inhibering og dermed dannelse af<br />
ethanol, se Afsnit 3.4. Efter at sukkerkoncentrationen igen faldt, blev ethanolen nedbrudt. Ved<br />
slutningen af fermenteringen var koncentrationen af både sukker og ethanol lav.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 46 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
Koncentration [g/L]<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
7.5.5 Deldiskussion 5<br />
5<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.14: Sukker- og ethanolkoncentrationen under f5.<br />
Ethanol<br />
Sukker<br />
Det ses af resultaterne for f5, at hvis koncentrationen af sukker var lav, skete der ikke en<br />
inhibering, og ethanol kunne omdannes. Dette var ønskværdigt, da ethanol formentlig blev<br />
omdannet til cellemasse. Det ses, at da substrattilledningen blev startet, steg<br />
sukkerkoncentrationen mere end ønsket, Dette skete under både f4 og f5, se Figur 7.14 og<br />
Måledata 4, derfor blev der set nærmere på denne tilledning.<br />
7.6 Tilledningsprofil<br />
Tilledningen af substrat under fermentering 2, 3, 4 og 5 ses af Figur 7.15.<br />
0,7<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
f3<br />
f 2<br />
0,7<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
a) Tilledningsprofil for f2 og f3. b) Tilledningsprofil for f4 og f5.<br />
Figur 7.15: Tilledningsprofil for f2, f3, f4 og f5.<br />
Da der ikke blev tilledt noget substrat under f1, ses den ikke af Figur 7.15. Der er en<br />
væsentlig forskel mellem f2, f3 og f4, f5, hvilket er starttidspunktet for tilledningen af substrat.<br />
Under f2 og f3 blev tilledningen af substrat startet efter ca. 10 timer, hvor der under f4 og f5<br />
først blev startet efter ca. 15 timer. Desuden ses, at i alle fire tilfælde blev tilledningen af<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 47 af 73<br />
f4<br />
f 5
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
substrat startet med et signal på 0,3. Dette er et stort trin fra 0 i forhold til de mindre trin på<br />
0,1.<br />
Under f5 blev der til sidst skruet op til 0,6 uden, at dette betød en stigning i sukkerkoncentrationen,<br />
se Figur 7.14. Derfor må der kunne skrues endnu mere op sidst i<br />
fermenteringsforløbet. Et forslag til dette ses på Figur 7.16. Den afbildede tilledningsprofil er<br />
et 2. gradspolynomium, der er tilpasset en eksponentiel funktion. Dette er valgt på baggrund<br />
af, at gæren har et eksponentielt vækstforløb, se Afsnit 4.4. Desuden er det valgt at anvende<br />
en kontinuert funktion, da der hermed ikke manuelt skulle skrues op for substrattilledningen.<br />
Pumpe signal [V]<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 48 af 73<br />
f5<br />
Profil<br />
0s ≤ t < 54000s : V = 0<br />
54000s ≤ t < 122400s : V = 1,1350⋅10 ⋅t−8,7422⋅10 ⋅ t + 2,5597 ⋅10<br />
Figur 7.16: Tilledningsprofil for f5 og ønsket tilledningsprofil for f6.<br />
−10 2 −6−1 Det ses af Figur 7.16, at tilledningsprofilen starter blidere end tilledningen ved f5, og at der<br />
til slut tilledes mere end under f5. På denne måde kan inhibering pga. en stigende sukker<br />
koncentration i starten undgås, og en for lav koncentrationen ikke bliver begrænsende til slut.<br />
Det besluttes at følge denne tilledningsprofil under f6.<br />
7.7 Fermentering 6<br />
Formålet med fermentering 6 (f6) var at udføre en fermentering, hvor substrattilledningen<br />
fulgte et bestemt forløb samt at undgå en stigning i sukkerkoncentrationen, når tilledningen af<br />
substrat blev startet.<br />
.
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.7.1 Startbetingelser f6<br />
Substratet til batchfermenteringen under f6 havde en sukkerkoncentration på 7,25 g<br />
L . Desuden<br />
blev der anvendt en podemængde på 200 mL, en omrørerhastighed på 700 O<br />
min<br />
samt sat et<br />
overtryk på fermentoren på 0,2 bar. Øvrige betingelser, se Afsnit 6.3. Måledataene og<br />
resultaterne for fermenteringen ses i Måledata 6, og de vigtigste elementer diskuteres i<br />
nedenstående.<br />
7.7.2 pH og temperatur f6<br />
Temperaturen for f6 lå på et stabilt og tilfredsstillende niveau, se Måledata 6, hvorimod der<br />
var et stort udsving i pH, se Figur 7.17.<br />
pH<br />
9,0<br />
8,6<br />
8,2<br />
7,8<br />
7,4<br />
7,0<br />
6,6<br />
6,2<br />
5,8<br />
5,4<br />
5,0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.17: pH-forløb under f6.<br />
Det ses af Figur 7.17, at pH værdien startede omkring 5,4, hvorefter den steg kraftigt, da<br />
der blev tilledt ammoniakvand. Derfor blev der slukket for pH reguleringen. Stigningen i pH<br />
skyldtes formentlig en løs forbindelse til både pH-elektroden og til pumperne, der regulerede<br />
pH. Fermenteringen fik lov til at forsætte og stod sådan i ca.10 timer (natten over).<br />
Efter 10 timer blev der rettet op på pH-værdien. Den præcis årsag til fejlen kunne ikke<br />
findes, men efter at have tjekket ledninger mm. virkede reguleringen igen, og der kom igen et<br />
fornuftig signal fra elektroden og til pumperne. Så efter ca. 10 timer blev der tændt for pHreguleringen<br />
igen, og pH indstillede sig på omkring 5,4; se Figur 7.17.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 49 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.7.3 Ilt f6<br />
Iltkoncentrationen lå omkring 9 mg<br />
L<br />
, som det ses af Figur 7.18, hvilket er som forventet lige<br />
under opløseligheden på 9,33 mg<br />
L . Da iltkoncentrationen ikke var faldet efter 23 timers<br />
fermentering, må nølefasen stadig have været den dominerende.<br />
Ilt [mg/L]<br />
10<br />
9<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.18: Ilt koncentration under f6.,<br />
7.7.4 Sukker- og ethanolkoncentration f6<br />
Det ses af Figur 7.19, at koncentrationerne af både sukker og ethanol fra starten var lav, men<br />
at de begyndte at stige efter ca. 15 timer. Dette skyldes, at her blev substrattilledningen startet.<br />
Dette bevirkede den forhøjede sukkerkoncentration samt inhibering af den vækst, der skulle<br />
finde sted, men som set ud fra iltkoncentrationen på Figur 7.18 endnu ikke var begyndt.<br />
Koncentration [g/L]<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 7.19: Sukker- og ethanolkoncentrationen under f6.<br />
Ethanol<br />
Sukker<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 50 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.7.5 Deldiskussion 6<br />
Da gæren sandsynligvis ikke havde påbegyndt den eksponentielle fase efter 23 timer, blev det<br />
besluttet at stoppe fermentering 6. Dette blev gjort på baggrund af at pH-værdien ikke var<br />
tilfredsstillende de første 10 timer. Herudover steg sukkerkoncentrationen, da tilledning af<br />
substrat blev startet. Desuden blev der ikke observeret en stigning i tørstofindholdet ved<br />
prøveudtagningen.<br />
Der burde have været foretaget endnu en fermentering, da f6 mislykkedes, så det kunne<br />
undersøges om tilledningsprofilen virkede efter hensigten. Dette blev ikke gjort af<br />
tidsmæssige årsager.<br />
7.8 Kulturrenhed<br />
Der blev under den sidste prøveudtagning ved hver fermentering udtaget en steril prøve af<br />
fermenteringsvæske, som blev overfladeudsået på YPG-plader, se Afsnit 6.5.4, for at<br />
undersøge om fermenteringerne foregik under sterile forhold. Der blev foretaget to<br />
pladeudspredninger pr. fermentering i tilfælde af kontaminering. Bestemmelse af kulturrenhed<br />
blev foretaget ved synsmæssige skøn, se Tabel 7.1.<br />
Fermentering YPG-plade 1 YPG-plade 2<br />
f1 - -<br />
f2 - -<br />
f3 - -<br />
f4 - -<br />
f5 - -<br />
f6 - -<br />
Tabel 7.1: Kulturrenhed.<br />
- : ingen kontaminering<br />
+ : kontaminering<br />
Der blev ikke observeret nogen kontaminering ved de seks fermenteringer, hvorved det<br />
kan konkluderes, at væksten under fermenteringerne udelukkende var forsaget af S. cerevisiae.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 51 af 73
K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2<br />
7.9 Prøveudtagning<br />
Under fermentering 1 blev der udtaget prøver hver time. Det blev hurtigt klart, at dette blev<br />
meget presset, så det blev valgt at udtage prøver med større mellemrum. Herefter blev der<br />
udtaget prøver ned til hver 2. time, hvilket gav 7 til 19 prøver pr. fermentering, se Måledata 1<br />
til 6. Grunden til den hyppige prøveudtagning var, at der ønskes flere prøver under en<br />
fermentering, således at der blev opnået et bedre billede af vækstens forløb, i forhold til<br />
projektet af Forssling et al., hvor der kun blev udtaget 4 til 7 prøver pr. fermentering.<br />
For at kunne vurdere om det kan retfærdiggøres at udtage prøver så ofte som der er gjort i<br />
dette projekt, undersøges om der er signifikant forskel på de enkelte tørstofprøver, se Bilag 8.<br />
For nærmere gennemgang af anvendt statistik, se Bilag 6. Det ses i Bilag 8 at det kan<br />
retfærdiggøres at der udtages prøver ned til hver 2. time.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 52 af 73
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
8 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter<br />
I dette afsnit beregnes respirationskoefficienten for fermentering f5 samt specifikke<br />
væksthastigheder og udbyttekonstanter for fermenteringerne.<br />
8.1 Respirationskoefficient<br />
Respirationskoefficienten (RQ) er defineret som:<br />
mol CO 2 dannet<br />
RQ =<br />
mol O forbrugt<br />
For at kunne finde antallet af mol CO2 dannet og mol O2 forbrugt, er det nødvendigt at<br />
finde en sammenhæng mellem koncentrationerne i ind- og udgangsgassen samt antallet af mol<br />
i disse strømme.<br />
Der ses på de to situationer, hvor der dannes et antal af mol og hvor der forbruges et antal af<br />
mol, se Figur 8.1.<br />
c(t)<br />
cud(t)<br />
cind(t)<br />
t<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 53 af 73<br />
2<br />
c(t)<br />
cind(t)<br />
t<br />
cud(t)<br />
a) Stigende koncentrationer/mol dannet. b) Faldende koncentrationer/mol forbrugt.<br />
Figur 8.1: Mol dannet og forbrugt.<br />
Først er det nødvendig at finde en sammenhæng mellem koncentrationen og antallet af mol.<br />
For at finde denne sammenhæng skal følgende sammenhænge kendes:<br />
- mellem koncentrationen (Ci) og molbrøken (yi) i gassen.<br />
- mellem mol (ni) og molbrøken (yi) i gassen.<br />
- mellem tiden t og volumen V(t) der er bobles gennem fermentoren.<br />
Disse sammenhænge ser ud som følgende:<br />
y(t)<br />
i<br />
C(t)<br />
100<br />
i = i = ⋅ i<br />
hvor : ν : Volumenflowet i<br />
R : Gaskonstanten i<br />
n<br />
P⋅V(t) R⋅T y (t)<br />
min = 4,17·10-4 3<br />
m<br />
3<br />
m<br />
s ν = 25 L<br />
3<br />
m ⋅Pa<br />
R = 8,31447 mol⋅K 3<br />
m ⋅Pa<br />
mol⋅K T : Temperaturen i K T = 303 K<br />
P : Totaltrykket i Pa<br />
s<br />
V(t) =ν⋅t
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
Kombineres dette, og summeres antallet af mol op over tiden fås følgende:<br />
ni t<br />
P⋅ν⋅t C(t) i<br />
ni⋅ dni = ⋅ ⋅dt<br />
R ⋅T<br />
100<br />
0 0<br />
P ⋅ν<br />
n = ⋅ t⋅C (t) ⋅dt<br />
⋅ ⋅ <br />
i i<br />
R T 100 0<br />
Ved beregning af antallet af mol forbrugt, er det forskellen fra i ind- til udgangsgassen, der<br />
skal findes. Dette er tilfældet med O2, hvilket gøres på følgende måde:<br />
∆ ni = ni ind −ni<br />
ud<br />
t t<br />
P⋅ν P⋅ν<br />
∆ n = ⋅ t⋅C (t) ⋅dt− ⋅ t⋅C (t) ⋅dt<br />
<br />
i iind i ud<br />
R ⋅T⋅100 R ⋅T⋅100 0 0<br />
t t<br />
<br />
∆ n = t⋅C (t) ⋅dt− t⋅C (t) ⋅dt<br />
i iind i ud<br />
0 0<br />
t<br />
<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 54 af 73<br />
t<br />
( )<br />
∆ n = t⋅ C (t) −C (t) ⋅dt<br />
i iind i ud<br />
0<br />
Ved beregning af antallet af mol dannet, er det omvendt forskellen fra ud- til<br />
indgangsgassen, der skal findes. Dette er tilfældet med CO2, hvilket gøres på følgende måde:<br />
t<br />
<br />
( )<br />
∆ n = t⋅ C (t) −C (t) ⋅dt<br />
i i ud i ind<br />
0<br />
8.1.1 Målinger på udgangsgassen<br />
For at finde koncentrationerne af de forskellige komponenter i ind- og udgangsgassen, er der<br />
fortaget målinger på GC samt fundet data over atmosfærens indhold. For komponenter i<br />
indgangsgassen anvendes de data, der ses i Tabel 8.1.<br />
Komponent Indhold i atmosfæren<br />
[%]<br />
Molbrøk<br />
y<br />
N2 78,1 0,781<br />
O2 20,9 0,209<br />
Ar 0,9 0,009<br />
CO2 0,0365 0,000365<br />
Tabel 8.1: Atmosfærens indhold [1], [4]<br />
iind
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
Ud over disse data er der foretaget en række antagelser. Det antages, at indgangsluften er<br />
tør, således at vandindholdet ikke ændrer på y iind.<br />
Desuden antages, at yAr ind = yArud.<br />
Derudover antages, at udgangsgassen er mættet med vand, hvilket giver følgende ligninger for<br />
bestemmelse af vandindholdet i udgangsgassen ved 30 °C:<br />
*<br />
p<br />
p<br />
2<br />
RF = 100% = 1 = yHOud<br />
2<br />
p<br />
P<br />
*<br />
H2O sat<br />
H2O =<br />
HO<br />
total<br />
sat<br />
HO 2<br />
p (30° C) = 4245,1 Pa<br />
Kombineres disse formler fås følgende udtryk for vandindholdet i udgangsgassen, ved 30 °C:<br />
y<br />
HOud 2<br />
sat<br />
RF⋅ pHO 2 4245,1<br />
= =<br />
P P<br />
total total<br />
Indsættes forskellige tryk fås følgende vandindhold, se Tabel 8.2.<br />
Overtryk<br />
Ptotal<br />
[Pa]<br />
2 HOud y<br />
0,0 bar 101325 0,0419<br />
0,2 bar 121325 0,0350<br />
0,5 bar 151325 0,0281<br />
Tabel 8.2: Vandindhold ved forskellige tryk.<br />
Koncentrationen af N2 og CO2 kendes, da disse blev målt vha. GC, se Afsnit 6.5.3. Herimod<br />
er det nødvendigt at udregne koncentrationen af O2, og denne kan udregnes ud fra<br />
koncentrationen af N2,CO2,H2O og Ar på følgende måde:<br />
C = 100 −C−C−C− C = 100 −C−C−100⋅y−100⋅y O2 N2 CO2 H2O Ar N2 CO2 H2O Ar<br />
Hvis der eksempelvis ved atmosfæretryk blev målt følgende koncentrationer af CO2 og N2:<br />
Fås følgende koncentration af O2:<br />
CCO = 5% og<br />
2<br />
CN= 80%<br />
2<br />
CO = 100 −80 −5−100⋅0,0419 −100⋅ 0,009 =<br />
9,91%<br />
2<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 55 af 73
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
8.1.2 Respirationskoefficient fra fermentering f5<br />
Udviklingen af CO2 og O2 i afgangsgassen fra f5 ses af Figur 8.2.<br />
CCO (g) [%] , CO (aq) [%]<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
CO2 O2 (aq) N2 O2 (g)<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 56 af 73<br />
100<br />
Figur 8.2: Koncentrationer i udgangsgassen og iltkoncentrationen i væsken under f5.<br />
Det ses af Figur 8.2, at CO2-koncentrationen er svag stigende, hvilket tyder på, at det sker<br />
en omdannelse i fermentoren. Desuden ses det, at der stadig er ilt i udgangsgassen, hvilket<br />
betyder, at luftflowet gennem fermentoren er tilstrækkelig. På Figur 8.2 ses, at der efter 30<br />
timer næsten ikke var opløst noget ilt i fermenteringsvæsken, hvorimod der stadig er ilt i<br />
udgangsgassen. Dermed er det ikke luftflowet ν, der er for lille, men derimod iltoverførslen<br />
KLa, se Afsnit 5.2.<br />
8.1.3 Beregning af antal mol CO2 dannet.<br />
Koncentrationen af CO2 i ind- og udgangsgassen er afbildet som funktion af tiden, se Figur<br />
8.3. Udgangskoncentrationerne er tilnærmet med et 2. gradspolynomium, mens<br />
indgangskoncentrationen har en konstant værdi:<br />
2<br />
C CO2 ud (t) = 0,0011⋅ t + 0,0008⋅ t + 0,0365<br />
C CO2 ind (t) =<br />
0,0365<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
CN (g) [%] , CO (g) [%]
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
CCO2(g) [%]<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
0,0<br />
Herefter er det muligt at udregne<br />
CO2 ud CO2 ind<br />
y = 0,0011x 2 + 0,0008x + 0,0365<br />
y = 0,0365<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 8.3: CO2 koncentration i ind- og udgangsgassen under f5.<br />
t<br />
<br />
∆n vha. den tidligere definerede ligning:<br />
CO2<br />
( )<br />
∆ n = t⋅ C (t) −C (t) ⋅dt<br />
CO2 CO2 ud CO2 ind<br />
0<br />
Herudfra opnås følgende resultater:<br />
t [timer] 9 14 19 24 29 34<br />
∆ n [mol] 3 14 44 105 215 398<br />
CO2<br />
8.1.4 Beregning af antal mol O2 forbrugt<br />
Koncentrationen af O2 i ind- og udgangsgassen er afbildet som funktion af tiden, se Figur 8.4.<br />
Udgangskoncentrationerne er tilnærmet 9 med en ret linie, mens indgangskoncentrationen er<br />
en konstant værdi:<br />
C O2ud(t) =−0,3927⋅ t + 20,9<br />
C O2ind(t) = 20,9<br />
9 Dette er en meget grov tilnærmelse.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 57 af 73
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
Herefter kan<br />
C [%]<br />
O2<br />
25,0<br />
20,0<br />
15,0<br />
10,0<br />
5,0<br />
0,0<br />
O2 ud O2 ind<br />
y = -0,3927x + 20,9<br />
y=20,9<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 8.4: O2 koncentration i ind- og udgangsgassen under f5.<br />
∆n udregnes ud fra den tidligere definerede ligning:<br />
t<br />
<br />
( )<br />
∆ n = t⋅ C (t) −C (t) ⋅dt<br />
O2 O2 ind O2 ud<br />
0<br />
Herudfra opnås følgende resultater:<br />
t [timer] 9 14 19 24 29 34<br />
∆ n [mol] 95 359 898 1810 3193 5144<br />
O2<br />
8.1.5 RQ<br />
Ud fra ovenstående beregninger af antallet af mol O2 forbrugt og CO2 dannet, er det muligt at<br />
beregne RQ ud fra følgende formel:<br />
∆nCO2<br />
RQ =<br />
∆n<br />
Herved kan respirationskoefficienten afbildes som funktion af tiden, se Figur 8.5.<br />
t [timer] 9 14 19 24 29 34<br />
RQ 0,032 0,040 0,049 0,058 0,067 0,077<br />
RQ<br />
0,09<br />
0,08<br />
0,07<br />
0,06<br />
0,05<br />
0,04<br />
0,03<br />
0,02<br />
0,01<br />
0<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 58 af 73<br />
O2<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Figur 8.5: Respirationskoefficient som funktion af tiden.
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
De opnåede respirationskoefficienter ligger meget lavt. Ud fra tidligere definerede<br />
respirationskoefficient-intervaller, så indikerer værdier under 0,6 ethanolnedbrydning, se<br />
Afsnit 3.2.3. Der er dog stor usikkerhed på GC-målingerne samt den tilpassede ligning for<br />
C iud(t),<br />
hvilket betyder, at der ikke er korrekt at foretage en konklusion omkring væksten af<br />
S, cerevisiae på baggrund af respirationskoefficienterne.<br />
8.2 Specifik væksthastighed<br />
Væksthastigheden er et udtryk for, hvor hurtigt cellerne vokser, denne måles ofte som<br />
ændringen i cellemasse pr. tid dX <br />
<br />
dt .<br />
Den specifikke væksthastighed er et udtryk for væksthastigheden pr. cellemasse. Den<br />
specifikke væksthastighed () er givet ved [6]:<br />
1 dX<br />
µ = ⋅<br />
X dt<br />
Dette kan omskrives på følgende måde:<br />
Xslut t<br />
1 1<br />
⋅ dX = µ ⋅dt dX µ dt ln(X slut ) ln(X start ) µ t<br />
X ⋅ = ⋅ − = ⋅<br />
X <br />
Xstart 0<br />
Herudfra fås følgende ligning for en ret linie:<br />
ln(X ) = µ ⋅ t + ln(X )<br />
slut start<br />
8.2.1 Beregning af den specifikke væksthastighed for f5<br />
Den specifikke væksthastighed for f5 kan udregnes vha. podemængden, koncentrationen af<br />
cellemasse ved hver prøveudtagning samt tiden for prøveudtagningerne, disse oplysninger ses<br />
i Tabel 8.3.<br />
t [timer] X slut [g] ln(X slut)<br />
9 4,8 1,56<br />
11 7,7 2,04<br />
13 12,5 2,52<br />
15 15,2 2,72<br />
17 25,2 3,23<br />
19 43,5 3,77<br />
21 69,6 4,24<br />
23 102,6 4,63<br />
26 155,3 5,05<br />
29 257,0 5,55<br />
32 409,7 6,02<br />
34 506,8 6,23<br />
Tabel 8.3: Værdier til beregning af µ under f5.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 59 af 73
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
ln(Xslut) indtegnes som funktion af tiden, og µ kan herefter findes som liniens hældning, se<br />
Figur 8.6b). Ved udregning af den specifikke væksthastighed, var det forventet at der var flere<br />
vækstforløb for hver fermentering, da gæren som tidligere nævnt vil have både en nøle- og<br />
eksponentiel vækstfase. Ses der nærmere på en af kurverne fra de resterende fermenteringer,<br />
for eksempel f3, se Figur 8.6a).<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
y = 0,00x + 0,70<br />
y = 0,18x - 1,29<br />
R 2 =1,00<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
y = 0,20x - 0,22<br />
R 2 =0,99<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 60 af 73<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
a) Specifik væksthastighed for f3. b) Specifik væksthastighed for f5.<br />
Figur 8.6: Den specifikke væksthastighed for f3 og f5.<br />
På Figur 8.6a) ses, at ind til 10 til 15 timer er væksthastigheden nul, hvorfor gæren stadig<br />
har befundet sig i nølefasen. Til beregning af den specifikke væksthastighed for de<br />
fermenteringer, hvor nølefasen er observeret ved prøveudtagningerne, er disse punkter<br />
sorteret fra. Den specifikke væksthastighed for samtlige fermenteringer ses i Tabel 8.4.<br />
Fermentering<br />
µ<br />
[h -1 ]<br />
f1 0,10<br />
f2 0,11<br />
f3 0,18<br />
f4 0,25<br />
f5 0,20<br />
f6 0,12<br />
Tabel 8.4: Specifikke væksthastigheder<br />
De specifikke væksthastigheder, der er fundet ved de seks fermenteringer, antager en værdi<br />
mellem0,10og0,25h -1 . Det ses af Tabel 8.4, at den specifikke væksthastighed svinger en del<br />
fra fermentering til fermentering, men det er umiddelbart svært at sammenligne de forskellige<br />
specifikke væksthastigheder, da der er ændret på flere forskellige parametre mellem hver<br />
fermentering. Det er altid ønskværdigt at have en høj specifik væksthastighed, men denne er<br />
ikke det samme som et godt udbytte. Hermed menes at en høj specifik væksthastighed i en<br />
kort periode godt kan give et mindre udbytte end en lav specifik væksthastighed i en længere<br />
periode.
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
I Forssling et al. blev der opnået specifikke væksthastigheder på mellem 0,16 og 0,18 h -1 ,<br />
og sammenlignes disse værdier med de specifikke væksthastigheder i Tabel 8.4, ses at det er<br />
muligt at opnå en højere specifik væksthastighed. Hvis gæren samtidig kan opretholde denne<br />
specifikke væksthastighed i en længere periode, er det muligt at opnå et højt udbytte af<br />
cellemasse.<br />
8.3 Udbyttekonstanter<br />
For at bestemme hvor stort et cellemasseudbytte, der er dannet ved fermenteringerne i forhold<br />
til mængden af substrat der er forbrugt, udregnes udbyttekonstanten, Y X . Denne er defineret<br />
S<br />
som følgende:<br />
Y<br />
X S<br />
g cellemassse dannet<br />
=<br />
g substrat forbrugt<br />
Ved beregning af udbyttekonstanten er der flere parametre, der kan tages højde for, alt efter<br />
hvilke oplysninger der ønskes fra udbyttekonstanten. I dette afsnit vil to forskellige værdier af<br />
udbyttekonstanten blive udregnet. Før udbyttekonstanten kan beregnes, skal den dannede<br />
mængde af cellemasse og den forbrugte mængde af sukker bestemmes. Dette er gjort for f5 i<br />
Tabel 8.5.<br />
Cellemasse<br />
Volumen<br />
[L]<br />
Koncentration<br />
[g/L]<br />
Mængde<br />
[g]<br />
Til slut 11,35 44,66 506,9<br />
Til podning 0,20 4,00 0,8<br />
Dannet - - 506,1<br />
Sukkerforbrug<br />
Volumen<br />
[L]<br />
Koncentration<br />
[g/L]<br />
Mængde<br />
[g]<br />
Tilsvarende<br />
substratmængde<br />
[g]<br />
Batch 3,50 7,25 25,4 25,4<br />
Tilledt 7,66 145,00 1110,7 1110,7<br />
Total - - - 1136,1<br />
Substrat til slut<br />
Volumen<br />
[L]<br />
Koncentration<br />
[g/L]<br />
Mængde<br />
[g]<br />
Tilsvarende<br />
substratmængde<br />
[g]<br />
Slutvolumen 11,35 - - -<br />
Restsukker - 0,00 0,0 0,0<br />
Restethanol - 2,41 27,4 66,8<br />
Tabel 8.5: Beregning af cellemasse og mængden af substrat for f5, yderligere oplysninger se Måledata 1 – 6.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 61 af 73
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
Udregningen af ” Tilsvarende substrat mængde” for ”restethanol” i Tabel 8.5, er foretaget<br />
på følgende måde:<br />
hvor de 0,41 er: YE<br />
Mængde<br />
Tilsvarende substrat mængde =<br />
0, 41<br />
S<br />
g ethanol dannet<br />
=<br />
g glucose forbrugt<br />
Her er det antaget, at udbyttekonstanten, Y E , der er fundet ud fra et substrat indeholdende<br />
S<br />
glucose, kan anvendes, når der anvendes sukker som substrat.<br />
Til udregning af udbyttekonstanten anvendes den dannede cellemasse, massen af det<br />
substrat, der er blevet tilført samt det substrat, der er anvendt til produktion af andre stoffer,<br />
her ethanol. Derved fås følgende:<br />
m 506,1g<br />
cellemasse<br />
g cellemasse dannet<br />
YX= = = 0,47 g sukker forbrugt<br />
S mtilledt substrat −mrestsukker −methanol 1136,1g−0,0g−66,8 Ved opformering af gærceller i industrien er det ikke interessant at se på, hvor meget af<br />
substratet, der er anvendt til produktion af andre produkter end cellemasse, som f.eks. ethanol.<br />
Her er det kun interessant at se størrelsen af den mængde cellemasse, der dannes i forhold til<br />
den mængde substrat, der anvendes i processen. Derfor udregnes udbyttekonstanten på<br />
følgende måde, se Tabel 8.6:<br />
m 506,1g<br />
cellemasse<br />
g cellemasse dannet<br />
YX= = = 0,45 g sukker forbrugt<br />
S mtilledt substrat 1136,1g<br />
Det ses ud fra beregninger af udbyttekonstanten for f5, at der ikke fås den store forskel om der<br />
tages højde for restsukker og ethanol eller om der kun ses på den dannede cellemasse i<br />
forhold til det tilledte substrat.<br />
Fermentering<br />
f1 0,15<br />
f2 0,21<br />
f3 0,11<br />
f4 0,12 *<br />
f5 0,45<br />
f6 0,01 **<br />
Værdierne for udbyttekonstanten er udregnet efter 34 timers fermentering.<br />
* ) Udregnet efter 26 timer, da fermentoren skummede over på dette tidspunkt. Udbyttekonstanten til slut er op<br />
imod 3 gange større end denne, dette skønnes ud fra at tørstofkoncentrationen, som de sidste 8 timer stiger fra 10<br />
til 28 g<br />
L , se Måledata 4. Den reelle udbyttekonstant er måske **<br />
) Udregnet efter 23 timer.<br />
28 YX≈ ⋅0,12≈ 0,30.<br />
10<br />
S<br />
Tabel 8.6: Udregnede værdier for YX<br />
S<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 62 af 73<br />
YX<br />
S
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
Det er valgt at udregne udbyttekonstanten, hvor der ikke tages højde for restsukker og<br />
ethanol, da denne værdi er lettere at sammenligne med tidligere opnåede værdier af Forsling<br />
et al. og andre. Desuden er det sjældent at restsukker og -ethanol kendes, hvorimod<br />
cellemassen og mængden af sukker ofte kendes.<br />
Udbyttekonstanterne fra Tabel 8.6 er afbildet i Figur 8.7, så det er lettere at se udviklingen af<br />
disse gennem fermenteringerne.<br />
Yx/s<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0,0<br />
f1 f2 f3 f4 f5 f6<br />
Figur 8.7: Udviklingen af YX gennem fermenteringerne.<br />
S<br />
Det ses af Figur 8.7, at udbyttekonstanten generelt stiger fra den ene fermentering til den<br />
anden. Udbyttekonstanterne for f3 og f6 er dog forholdsvis lave, hvilket skyldes, at<br />
fermenteringerne aldrig nåede at komme i gang. Ved f4 ses med den mørke farve den<br />
beregnede udbyttekonstant efter 26 timer og den lyse farve den forventede efter 34 timer.<br />
f1 var en batchfermentering, hvor der blev opnået en udbyttekonstant på 0,15<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt ;<br />
hvilket stemmer overens med den teoretiske udbyttekonstant for anaerob vækst på mellem<br />
0,11 og 0,15<br />
g cellemasse dannet<br />
g substrat forbrugt<br />
; se Afsnit 3.2.1. Ved f2 var sukkerkoncentrationen blev mindsket<br />
med en faktor 10, hvorved væksten undervejs både har været aerob og anaerob. Dette har<br />
medvirket til at give en højere udbyttekonstant på 0,21<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt . Herefter blev det forsøgt<br />
at gentage resultatet fra f2 ved f3, men dette mislykkedes, da gæren fik en forlænget nølefase<br />
pga. en for høj starttemperatur, derfor blev der kun opnået et udbytte på 0,11<br />
dermed formentlig ingen aerob vækst.<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt og<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 63 af 73
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
Ved f4 blev der foruden en halvering af sukkerkoncentrationen ændret på<br />
omrørerhastigheden og trykket i fermentoren. Herved blev det muligt at opløse mere ilt i<br />
fermenteringsvæsken, dog var der problemer pga. overtrykket, hvorfor slutvolumen ikke<br />
kendes og derfor kan den endelige udbyttekonstant ikke beregnes. Udbyttekonstanten blev i<br />
stedet beregnet efter 26 timer til 0,12<br />
endt fermentering estimeret til 0,30<br />
og anaerob vækst.<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt . Derudover blev udbyttekonstanten ved<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt<br />
Udbyttekonstanten for f5 antager en værdi på 0,45<br />
på den teoretisk maksimale udbyttekonstant på 0,46 til 0,47<br />
; derfor antages at der har været både aerob<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt , hvilket ligger meget tæt<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt , se Afsnit 3.2.1. Det<br />
var denne værdi, der blev forsøgt at opnå i dette projekt.<br />
Generelt ses det i Figur 8.7, at de ændringer, der er fortaget undervejs i fermenteringerne<br />
har haft en positiv effekt på udbyttekonstanten, og da der er lykkedes at opnå en<br />
udbyttekonstant i nærheden af den maksimale, vil det herefter være muligt at foretage en<br />
yderligere optimering af S. cerevisiaes opformering med de ændringer, der er foretaget i<br />
forhold til fermentering 1.<br />
8.4 Fermenteringsparametre<br />
Der er som nævnt foretaget en del ændringer af forskellige parametre fra fermentering 1 til<br />
fermentering 6. De parametre der kan arbejdes videre med beskrives herunder.<br />
Ved alle fermenteringerne blev der anvendt en pH-værdi på 5,4 og en temperatur på 30 °C.<br />
Derudover er der ud af fundet, at en omrørerhastighed på 700 O<br />
min<br />
og et overtryk på 0,2 bar<br />
giver en bedre iltoverførsel. Det er forsøgt at variere på sukkerkoncentrationen i startsubstratet<br />
til batchfermenteringen, og en startkoncentration på 7,25 g<br />
L gav det bedste resultat, se Tabel<br />
8.7. Der er desuden forsøgt med en tilledningsprofil, se Figur 8.8. Dog uden resultat.<br />
Parameter Værdi<br />
pH 5,4<br />
Temperatur 30 °C<br />
Overtryk 0,2 bar<br />
Omrørerhastighed 700 O<br />
min<br />
Sukkerkoncentration i batch 7,25 g<br />
L<br />
Tabel 8.7: Fundne parametre.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 64 af 73
K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2<br />
Pumpe signal [V]<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
0s ≤ t < 54000s : V= 0<br />
54000s ≤ t < 122400s : V = 1,1350⋅10 ⋅t−8,7422⋅10 ⋅ t + 2,5597 ⋅10<br />
Figur 8.8: Tilledningsprofil.<br />
−10 2 −6−1 Ingen af de fundne værdier er endegyldige, og der er ikke optimeret på de enkelte værdier.<br />
Der er dog under f5 opnået et cellemasseudbytte på 0,45<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt<br />
; med de i Tabel 8.7<br />
nævnte parametre, hvilket kunne tyde på, at de anvendte parametre ligger i samme område<br />
som de optimale.<br />
Til et senere forsøg anbefales at udføre en prøvefermentering evt. som f6, for at få noget<br />
erfaring med fermentoren mm., hvorefter fermentering 6 endnu engang efterprøves for at se<br />
om tilledningensprofilen fungerer som forventet. Opnås der her et højt cellemasseudbytte, kan<br />
der herefter evt. optimeres på de enkelte parametre.<br />
De nævnte parametre gælder kun for MBR fermentoren, der er anvendt til<br />
fermenteringerne i dette projekt, som er udført på Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 65 af 73
K-PRO 7 Diskussion Gruppe 2<br />
9 Diskussion<br />
Der blev i dette projekt udført seks fermenteringer for at tilpasse forskellige parametre til<br />
opformeringen af S. cerevisiae. Udfra disse seks fermenteringer blev der opnået<br />
udbyttekonstanter på mellem 0,11 og 0,45<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt , og det ses tydeligt i Figur 8.7, at der<br />
sker en udvikling fra f1 til f6 ved ændring af forskellige parametre. Udbyttekonstanten for f5<br />
på 0,45<br />
0,47<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt ligger tæt på den teoretisk maksimalt opnåelige værdi mellem 0,46 og<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt ; hvorfor de parametre, der er blevet ændret undervejs, kan anvendes til<br />
yderligere at optimere opformeringen af S. cerevisiae.<br />
De fermenteringsparametre, der blev fundet til optimering af cellemasseudbyttet ved<br />
opformeringen, er en omrørerhastighed på 700 O<br />
min , et overtryk i fermentoren på 0,2 bar, en<br />
sukkerkoncentration på 7,25 g<br />
L i startsubstratet samt forslag til en tilledningsprofil, som ses i<br />
Afsnit 7.6.<br />
Da f5 som nævnt gav gode resultater, vil det være en god ide ved fortsættelse af dette<br />
projekt at køre f6 igen, da denne var en forbedring af f5. Tilledningsprofilen i f6 vil<br />
formentlig give en lavere sukkerkoncentration i begyndelsen samt en hurtigere tilledning ved<br />
slutningen af fermenteringen, hvorved der formentlig undgås Crabtree-effekt og<br />
substratinhibering. På denne måde holdes gæren i den eksponentielle vækstfase i længere tid.<br />
Dermed opnås en meget lav inhiberende virkning under hele fermenteringen, hvilket<br />
formentlig vil medføre et højere cellemasseudbytte.<br />
En af de parametre, der bør optimeres yderligere på, er iltoverførslen i den anvendte<br />
fermentor, da de praktiske KLa-værdier på 0,0123 h -1 ved 400 O<br />
min og 0,0198 h-1 ved 700 O<br />
min<br />
er forholdsvis lave i forhold til de estimerede på 0,030 h -1 ved 400 O<br />
min og 0,132 h-1 ved 700<br />
O<br />
min<br />
. Dette kunne optimeres ved at ændre omrørerhastigheden samt udformningen af<br />
iltfordeleren til fermentoren, således at der opnås en større gas-væske overflade og dermed en<br />
bedre iltoverførelse fra luftboblerne til væsken, hvilket vil give en højere KLa-værdi.<br />
Under fermenteringerne blev der erfaret forskellige praktiske elementer, som bør udbedres,<br />
før der foretages forsøg på at optimere opformeringen af S. cerevisiae yderligere, disse<br />
opsummeres og diskuteres herunder.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 66 af 73
K-PRO 7 Diskussion Gruppe 2<br />
Ved fermentering f3 var temperaturen oppe på 50 ºC i omkring 10 min., hvilket har svækket<br />
gæren og dermed gjort nølefasen længere. Ved fermentering f6 var der problemer med pHelektroden,<br />
pga. en løs forbindelse, hvilket gjorde at pH-værdien var for høj, dette svækkede<br />
også gæren og forlængede ligeledes nølefasen. Af disse to forsøg ses, at hvis der ikke er<br />
ideelle betingelser fra fermenteringens start, så skal opstarten udsættes, til det er muligt at<br />
genskabe de optimale betingelser. Sker der fejl tidligt i fermenteringsforløbet, så betingelserne<br />
for gæren ikke er optimale, bør fermenteringen standses med det samme.<br />
Sammenlignes fermentering f2 og f5 ses, at ved et moderat overtryk på 0,2 bar, er det<br />
muligt at opløse mere ilt i fermenteringsvæsken, og at gæren har mere ilt til rådighed ved f5,<br />
hvorfor iltkoncentrationen ikke er nær så begrænsende som ved f2. Dette ses af faldet i<br />
iltkoncentrationen fra mætning til nulpunkt på Figur 7.8 og Figur 7.13, da hældningen på<br />
kurven ved f2 er stejlere end hældningen på kurven ved f5. Derudover ses det ved<br />
bestemmelse af KLa, at en ændring af omrørerhastigheden fra 400 til 700 O<br />
min<br />
har en positiv<br />
effekt på iltoverførslen, dette er formentlig medvirkende til den ændrede hældning på<br />
ovennævnte iltkurver.<br />
Som det fremgik af fermentering f4, så er det muligt at opløse mere ilt i<br />
fermenteringsvæsken ved et højt overtryk, som f.eks. 0,5 bar. Problemet var dog, at<br />
slangepumperne til væsketilledning ikke kunne pumpe imod dette tryk. Hvis der skal<br />
anvendes overtryk under fermenteringen er det nødvendigt at anskaffe nogle pumper, som kan<br />
pumpe mod et højere tryk, så det er muligt at øge opløseligheden af ilt i væsken. Der blev<br />
anvendt en kompressor til frembringelse af luftflowet på 25 L<br />
min . Kompressoren virkede ikke<br />
optimalt, da det var nødvendigt at køle på denne uafbrudt for at forhindre at den satte ud pga.<br />
overophedning. Dette skyldes, at kompressorens kapacitet kun lige var stor nok til at<br />
frembringe det førnævnte luftflow. Eventuelt skal der anskaffes en større kompressor eller ske<br />
en tilkobling til et permanent trykluftsystem.<br />
Der var en del problemer med at kalibrere pH-elektroden gennem projektperioden. Der var<br />
en løs forbindelse i kablet, som forbandt kontrolenheden og pH-elektroden. Det var højst<br />
sandsynlig denne løse forbindelse, som ødelagde væksten under f6.<br />
Derfor er det nødvendigt at få pH-elektroden samt kabel og kontrolenhed undersøgt, og<br />
eventuelt må der anskaffes en ny elektrode eller et nyt kabel.<br />
Til prøveudtagning af udgangsgassen blev der anvendt en gasmus. Det var meget vigtigt<br />
under fermenteringerne, at gasmusen var tætnet ordentlig, da gasen ellers kunne sive ud<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 67 af 73
K-PRO 7 Diskussion Gruppe 2<br />
gennem musen og derved ændre koncentrationen af de enkelte gasser i prøven. Herudover<br />
blev der anvendt en gassprøjte som havde en skala, der gjorde det svært at udtage et præcist<br />
volumen hver gang. Gassprøjten blev herudover tilstoppet, så det var nødvendigt at rense<br />
denne mellem fermenteringerne.<br />
Gasmålingerne svingende meget, som det ses i Afsnit 8.1 og Måledata 1 til 6, hvilket<br />
antyder, at målingerne er ret upræcise. Respirationskoefficienten kan i dette projekt ikke<br />
direkte anvendes, da målingerne er upræcise. Derfor vil det være nødvendigt at optimere på<br />
metoden, så det er muligt at opnå nogle målinger, der er mere præcise. Samtidig kunne der<br />
eventuelt anskaffes en gasprøjte med en mindre skala, så det blev nemmere at udtage prøverne.<br />
Herudover kunne der anvendes et andet splitforhold, så der udtages en anden prøvemængde,<br />
men stadig sendes samme prøvevolumen ind i kolonnen. Optimeres metoden således, at<br />
gasmålingerne bliver mere præcise, forventes at respirationskoefficienten bliver mere<br />
anvendelig.<br />
Det er som nævnt lykkedes at opnå et cellemasseudbytte på 0,45<br />
g cellemasse dannet<br />
g sukker forbrugt , hvilket bør<br />
eftervises ved flere fermenteringer, hvorefter der evt. kan foretages en optimering af<br />
forskellige parametre.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 68 af 73
K-PRO 7 Konklusion Gruppe 2<br />
10 Konklusion<br />
I dette projekt blev der udført 6 fermenteringer for at tilpasse forskellige parametre til<br />
opformeringen af S. cerevisiae. De parametre, der blev tilpasset for at opnå et højt<br />
cellemasseudbytte ved opformeringen ses af Tabel 10.1.<br />
Parameter Værdi<br />
pH 5,4<br />
Temperatur 30 °C<br />
Overtryk 0,2 bar<br />
Omrørerhastighed 700 O<br />
min<br />
Sukkerkoncentration, batch 7,25 g<br />
L<br />
Pumpe signal [V]<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tid [timer]<br />
Tabel 10.1: Fundne parametre. Figur 10.1: Tilledningsprofil<br />
Ud over de tilpassede parametre, er der udarbejdet et forslag til en tilledningsprofil, hvor<br />
tilledningen starter efter 15 timeres fermentering, se Figur 10.1. Ved brug af ovenstående<br />
parametre er det lykkedes at opnå et cellemasseudbytte tæt på den teoretiske værdi. Der blev<br />
opnået udbyttekonstanter, som ligger mellem 0,11 og 0,45, hvor den teoretiske ligger mellem<br />
0,46 og 0,47.<br />
Udviklingen af cellemasseudbyttet gennem de forskellige fermenteringer ses af Figur 10.2.<br />
Her ses det tydeligt, at der sker en udvikling fra fermentering til fermentering, hvilket betyder<br />
at de ændringer der er foretaget under fermenteringerne har haft en positiv effekt.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 69 af 73
K-PRO 7 Konklusion Gruppe 2<br />
Yx/s<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0,0<br />
f1 f2 f3 f4 f5 f6<br />
Figur 10.2: Udviklingen af YX gennem fermenteringerne.<br />
S<br />
Herudfra bør der udvikles en metode, så det er muligt at opnå et højt cellemasseudbytte<br />
ved hver fermentering, så der samtidig opnås et cellemasseudbytte der ligger meget stabilt.<br />
Dette gøres for senere at kunne optimere på forskellige parametre.<br />
Undervejs i fermenteringerne er der visse elementer, der har bevirket, at fermenteringerne<br />
ikke har forløbet optimalt, dette gælder større udsving i pH og temperatur. Dette har resulteret<br />
i store udsving i cellemasseudbyttet. Ved sådanne udsving bør fermenteringen stoppes, da den<br />
ikke vil give et optimalt cellemasseudbytte, hvorfor det er vigtigt at finde en stabil metode<br />
uden større svingninger. Hvis mindre usikkerheder i metoden giver større svingninger i<br />
cellemasseudbyttet end variationerne i den parameter, der bliver optimeret på, kan en videre<br />
optimering ikke forsvares.<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 70 af 73
K-PRO 7 Bilags- og måledataliste Gruppe 2<br />
Bilag<br />
11 Bilags- og måledataliste<br />
Bilag 1 : Bestemmelse af KLa<br />
Bilag 2 : Huskelister, forsøgsbeskrivelser og resultatskemaer<br />
Bilag 3 : Bestemmelse af sukkerindhold<br />
Bilag 4 : Bestemmelse af ethanolindhold<br />
Bilag 5 : Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid<br />
Bilag 6 : Anvendt statistik<br />
Bilag 7 : Måling af tilledt volumen<br />
Bilag 8 : Prøveudtagning<br />
Måledata<br />
Måledata 1 : Måledata og resultater fra fermentering 1<br />
Måledata 2 : Måledata og resultater fra fermentering 2<br />
Måledata 3 : Måledata og resultater fra fermentering 3<br />
Måledata 4 : Måledata og resultater fra fermentering 4<br />
Måledata 5 : Måledata og resultater fra fermentering 5<br />
Måledata 6 : Måledata og resultater fra fermentering 6<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 71 af 73
K-PRO 7 Litteraturliste Gruppe 2<br />
Kilder<br />
12 Litteraturliste<br />
[1] : Databog fysik kemi, 8. udgave<br />
Andersen, E. S., Jespergaard, P. og Østergaard, O. G.<br />
F & K forlaget, 1994<br />
ISBN 87-87229-55-2<br />
[2] : Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook<br />
Atkinson, Bernard and Mavituna, Ferda<br />
M Stockton Press New York 1987<br />
ISBN 0-333-33274-1<br />
[3] : Biochemical Engineering Fundamentals 2. udgave<br />
Bailey, James E. og Ollis, David F.<br />
McGraw-Hill Inc. 1986<br />
ISBN 0-07-003212-2<br />
[4] : Environmental chemistry, 2. udgave<br />
Baird, Colin<br />
W. H. Freeman and Company, 1<strong>999</strong><br />
ISBN 0-7167-3153-3<br />
[5] : Optimering af fed-batchfermentering af genmodificeret Saccharomyces cerevisiae<br />
Forssling, Ann Sofie og Johnsen, Jesper, 2003<br />
Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum<br />
[6] : K-projekt 3 Fermenteringsteknologi<br />
Hansson, Torben<br />
Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum, 1<strong>999</strong><br />
[7] : Brock Biology of Microorganisms 9. udgave<br />
Madigan, Michael T., Martinko, John M. and Parker, Jack<br />
Prentice-Hall, New Jersey 2000<br />
ISBN 0-13-081922-0<br />
[8] : Lehninger Principles of Biochemistry, 3. udgave<br />
Nelson, David L. and Cox, Michael M.<br />
Worth Publishers 2000<br />
[9] : Fermentative Capacity of the Yeast Saccharomyces cerevisiae During Growth and Starvation<br />
Nilsson, Annika<br />
Department of Cell and Molecular Biology, Göteborg University 2001<br />
ISBN 91-628-4599-3<br />
[10] : The Yeasts vol. 3 Yeast Technology<br />
Rose, Anthony H. og Harrison J. S.<br />
Academic Press Inc. London 1970<br />
SBN 12-596403-X<br />
[11] : Regulation of carbon metabolism in Saccharomyces cerevisiae<br />
Sierkstra, Laurens<br />
Universiteit Utrecht, Faculteit Biologie, 1993<br />
ISBN 90-393-0396-7<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 72 af 73
K-PRO 7 Litteraturliste Gruppe 2<br />
[12] : Regulation of metabolism and cell cycle progression in the yeast Saccharomyces cerevisiae<br />
Silljé, Herman<br />
Universiteit Utrecht, Holland 1997<br />
ISBN 90-393-1289-3<br />
[13] : Principles of Fermentation Technology, 2. udgave<br />
Stanbury, P. F.; Whitaker, A. og Hall, S. J.<br />
Elsevier Science Ltd. 1995<br />
ISBN 0-08-036131-5<br />
[14] Praktisk microbiology<br />
Thougaard, Herluf; Varlund, Verner og Madsen, Rene Møller<br />
Teknisk forlag, 1996<br />
ISBN 87-571-1847-7<br />
[15] : Yeast physiology and biotechnology<br />
Walker, Graeme M.<br />
John Wiley & Sons, England 1998<br />
ISBN 0-471-96447-8<br />
Artikler<br />
[16] : Automated fed-batch culture of recombiant Saccharomyces cerevisiae based on on-line monitored<br />
maximum substrate uptake rate<br />
Oh, Gyuseop, Moo-Young, Murray og Chisti, Yusuf<br />
Biochemical Engineering Journal 1 (1998) pp. 211 – 217<br />
[17] : A kinetik and mass transfer model to simulate the growth of baker’s yeast in industrial bioreactors<br />
Serio, M. Di, Tesser, R. og Santacesaria, E<br />
Chemical Engineering Journal 82 (2001) pp. 347 – 354<br />
[18] : Optimal operation of fed-batch fermentations via adaptive control of overflow metabolite<br />
Valentinotti, S., Srinivasan, B. o.a.<br />
Control Engineering Practice 11 (2003) s. 665 – 674<br />
Hjemmesider<br />
[19] : http://www.aarhusakademi.<strong>dk</strong>/intranet/fagene/biologi/Roholt/hjemmeside/undervisning%20online/<br />
Hormoner/pancreas/insulin.html (29-11-03)<br />
[20] : http//www.kcl.ac.uk/kis/schools/life_sciences/life_sci/quinn/teaching/MSc/ModuleB (03-12-2003)<br />
Andet<br />
[21] : Materiale fra MBR fermentor<br />
[22] : Mundtligt fra Novo Nordisk A/S<br />
[23] : Skriftligt materiale fra Novo Nordisk A/S<br />
Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 73 af 73
Bilag 1<br />
Bestemmelse af KLa
K-PRO 7 Bestemmelse af KLa Gruppe 2<br />
1 Bestemmelse af KLa<br />
Det er muligt at bestemme KLa både ud fra estimering og praktiske forsøg, begge dele vil<br />
blive fortaget her.<br />
1.1 Bestemmelse af KLaestimeret<br />
KLa kan estimeres udfra nedenstående ligning [1], [2]:<br />
x<br />
Pair<br />
<br />
K La<br />
= k ⋅<br />
⋅<br />
( ) y<br />
V<br />
hvor: Pbeluftet :<br />
V <br />
Effektforbruget til iltoverførslen [W]<br />
V : Væskens volumen [m 3 ]<br />
Vs : Den lineære gashastighed [m/s]<br />
k,x og y : Konstanter<br />
Ovenstående formel gælder under følgende betingelser:<br />
V : 2 – 4400 L og Pbeluftet / V : 500 – 10.000 W/m³<br />
Ved lufttilførsel skelnes mellem to situationer; koaleserende eller ikke koaleserende<br />
luftbobler, hvor boblerne enten bliver større eller mindre op gennem fermentoren.<br />
a) Boblediameter i fermenteringsvæske b) Iltfordeler i MBR fermentor.<br />
Figur 1.1: Boblediameter og iltfordeler.<br />
Figur 1.1a) er et nærbillede af fermentoren i drift med ca. 10 L fermenteringsvæske. På<br />
billedet kan det svagt ses, at der er bobler i væsken, disse bobler har en diameter på ca. 1 mm.<br />
Udfra et synsmæssig skøn under fermenteringerne kunne det ses, at boblerne på billedet var<br />
nogle af de større bobler i fermenteringsvæsken og at der var en del mindre bobler i væsken.<br />
Bilag 1 Side 1 af 6<br />
s
K-PRO 7 Bestemmelse af KLa Gruppe 2<br />
På Figur 1.1b) ses iltfordeleren. Hullerne i denne har en diameter på ca. 2 mm. Da boblerne<br />
har en diameter, der er mindre end huldiameteren, må boblerne gå i stykker under<br />
opstigningen. Dette betyder, at forholdene i fermenteringsvæsken er ikke koaleserende.<br />
For en omrørt fermentor med ikke koaleserende luftbobler fås følgende konstanter til<br />
beregning af KLa[1]:<br />
k = 0,002<br />
hvilket medfører følgende ligning:<br />
x = 0,7 y = 0,2<br />
1.1.1 Den lineære hastighed, Vs<br />
Bilag 1 Side 2 af 6<br />
0,7<br />
P K a = 0,002⋅ ⋅ V<br />
V <br />
( )<br />
beluftet<br />
L s<br />
Vs er defineret som den lineære hastighed op gennem hele tværsnitsarealet i en luftfyldt<br />
fermentor [1]:<br />
hvor ν : volumenflow i<br />
<br />
V= s =<br />
2<br />
A 0,25⋅⋅D 3<br />
m<br />
s i dette projekt er ν =25 L<br />
D : diameteren af MBR fermentoren, her D = 0,2 m<br />
1.1.2 Pbeluftet/V<br />
For at finde beluftet P<br />
V<br />
[1], [2]:<br />
−4<br />
4,17⋅10 V = =<br />
A 0,25⋅π⋅0,2 s 2<br />
0,2<br />
min = 4,17·10-4 3<br />
m<br />
= 1,33·10 -2 m<br />
s<br />
forholdet er der nødvendig at finde Reynolds tal, dette gøres som følgende<br />
kg<br />
ρ : Densitet, 3<br />
m vand = 1000 kg<br />
3<br />
m<br />
µ : Viskositet,<br />
kg<br />
ms ⋅<br />
N<br />
Nomdrejninger : Omrørerhastighed O<br />
s<br />
Re<br />
ρ ⋅N ⋅ D<br />
=<br />
µ<br />
2<br />
omdrejninger omrører<br />
kg<br />
vand ved 30 °C = 0,85·10-3 ms ⋅<br />
Domrører : Diameter af omrører = 0,07 m<br />
s
K-PRO 7 Bestemmelse af KLa Gruppe 2<br />
Reynolds tal anvendes til at finde et Power number (NP), hvilket gøres som følgende:<br />
Nomdrejninger<br />
N<br />
100<br />
10<br />
Fladbladet omrører<br />
1<br />
1 10 100 1000 10000 100000 1000000<br />
NRe<br />
Figur 1.2: Power number som funktion af Reynolds tal [1].<br />
Nomdrejninger<br />
O min <br />
O s <br />
100 1,66 ~ 9.600 ~ 7<br />
200 3,33 ~ 19.200 ~ 7<br />
400 6,66 ~ 38.400 ~ 7<br />
700 11,66 ~ 67.300 ~ 7<br />
Tabel 1.1: Forholdet mellem Reynolds tal og NP<br />
Det ses af Tabel 1.1 og Figur 1.2, at når omrørerhastigheden, Nomdrejninger, er større end ca. 100<br />
O<br />
min fås en værdi for NP på ca. 7.<br />
Power numberet anvendes til at finde den effekt, der skal tilføres til fermentoren, hvis den<br />
ikke var beluftet (Puden beluftning). Dette gøres som følgende [1], [2]:<br />
N<br />
P<br />
Bilag 1 Side 3 af 6<br />
NRe<br />
uden beluftning<br />
P = 3 5<br />
ρ ⋅Nomdrejninger ⋅Domrører<br />
For at finde effekten til en beluftet fermentor (Pbeluftet) skal effekten til en ikke beluftet<br />
fermentor (Puden beluftning) omregnes. Dette gøres vha. beluftningshastigheden Nluft og forholdet<br />
Pbeluftet<br />
på følgende måde [1], [2]:<br />
P<br />
uden beluftning<br />
N<br />
=<br />
beluftning 3<br />
Nomdrejninger ⋅Domrører<br />
<br />
NP
K-PRO 7 Bestemmelse af KLa Gruppe 2<br />
Luftflowet gennem fermentoren i dette projekt: ν ≈ 25 L<br />
min ≈ 4,17·10-4 3<br />
m<br />
P<br />
P<br />
beluftet<br />
uden beluftning<br />
Nomdrejninger<br />
O min <br />
samt Pbeluftet er udregnet i Figur 1.3.<br />
Pbeluftet/ Puden beluftning<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
Nomdrejninger<br />
O s <br />
<br />
Fladbladet omrører<br />
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20<br />
Nbeluftning<br />
Nbeluftning<br />
Puden beluftning<br />
[W]<br />
s .Forholdet<br />
Bilag 1 Side 4 af 6<br />
P<br />
P<br />
beluftet<br />
uden beluftning<br />
Pbeluftet<br />
[W]<br />
400 6,66 0,182 3,48 0,35 1,22<br />
700 11,66 0,104 18,65 0,55 10,26<br />
Figur 1.3: Forholdet mellem Nbeluftning og Pbeluftet /Puden beluftning [1]<br />
1.1.3 Beregning af KLaestimeret.<br />
For at beregne KLaestimeret er det nødvendigt at kende væskevolumen i fermentoren, og da der<br />
under forsøgene køres kontinuert, ændres volumen løbende. Der startes ud med et volumen på<br />
3,5 L; og der sluttes med et volumen på mellem 11 og 12 L ~ 11,5 L, se Måledata 1 til 6,<br />
derfor ses der på det gennemsnitlige volumen:<br />
11,5L − 3,5L<br />
Vgnst = = 7,5 L = 7,5·10<br />
2<br />
-3 m³<br />
Herefter er det muligt at beregne KLaestimeret:<br />
0,7<br />
0,7<br />
Pbeluftet <br />
0,2 P<br />
0,2<br />
beluftet <br />
−2<br />
Ka L estimeret = 0,002⋅ ⋅(<br />
Vs<br />
) = 0,002⋅ 3 ( 1,33 10<br />
−<br />
)<br />
V<br />
⋅ ⋅<br />
<br />
7,5 ⋅10<br />
<br />
<br />
Nomdrejninger<br />
O min <br />
<br />
Nomdrejninger<br />
O s <br />
<br />
Pbeluftet<br />
[W]<br />
KLaestimeret<br />
[s -1 ]<br />
400 6,66 1,22 0,030<br />
700 11,66 10,26 0,132<br />
Tabel 1.2: KLaestimeret
K-PRO 7 Bestemmelse af KLa Gruppe 2<br />
Det ses af Tabel 1.2, at hvis omrøringen øges, så stiger KLa værdien.<br />
1.2 Bestemmelse af KLapraksis<br />
For at finde den volumetriske overførselskonstant, KLa, foretages et forholdsvis enkelt forsøg,<br />
se Afsnit 1.2.1.<br />
Til beregning af den estimerede KLa blev det gennemsnitlige volumen (7,5 L) anvendt,<br />
hvilket derfor også anvendes ved dette forsøg for bedre at kunne sammenligne resultaterne.<br />
DetermuligtatfindeKLavedmåle koncentrationen af ilt i vand som funktion af tiden,<br />
hvilket kan beskrives med følgende ligning [2]:<br />
Vedintegrationfås:<br />
dC L =KLa⋅C-CL dt<br />
* ( )<br />
* ( )<br />
ln C -C = -K a ⋅t<br />
+ b<br />
L L<br />
Heraf ses, at det er muligt at bestemme -KLa som hældningen ved afbildning af<br />
* ( L )<br />
ln C -C som funktion af tiden.<br />
1.2.1 Forsøgsbeskrivelse<br />
Fermentoren fyldes med 7,5 L vand, hvorefter omrøringen startes ved henholdsvis 400 og 700<br />
O<br />
min<br />
for at mætte væsken med ilt, inden forsøget startes.<br />
Herefter fjernes ilten i væsken ved at tilføre gasformig nitrogen til fermentoren, indtil<br />
iltniveauet når ned på nul. Nulpunktet holdes i nogle minutter. Herefter startes lufttilførslen<br />
samtidig med at tilførsel af N2 stoppes, og der måles på iltindholdet, indtil mætning med ilt er<br />
opnået [2].<br />
1.2.2 Resultater<br />
Ved de to forsøg er iltkoncentrationen målt i vandet som funktion af tiden, og herudfra fås<br />
Figur 1.4.<br />
Bilag 1 Side 5 af 6
K-PRO 7 Bestemmelse af KLa Gruppe 2<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
400 O/min<br />
0<br />
0 5 10<br />
Tid [min]<br />
15 2 0 2 5<br />
a) Målte iltkoncentrationer ved 400 O<br />
min<br />
Figur 1.4: Målte iltkoncentrationer ved 400 og 700 O<br />
min .<br />
700 O/min<br />
Bilag 1 Side 6 af 6<br />
Ilt [mg/L]<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25<br />
Tid [min]<br />
b) Målte iltkoncentrationer ved 700 O<br />
min<br />
Der ses af graferne i Figur 1.4, at opløsningen af ilt i væsken efter total fjernelse sker hurtigst<br />
ved 700 O<br />
min , idet hældningen er lidt stejlere. For det lineære liniestykke på de to grafer, dvs.<br />
*<br />
områdernemellem12og15minberegnes ( L )<br />
Figur 1.5.<br />
ln (C-CL)<br />
2,4<br />
2,2<br />
2,0<br />
1,8<br />
1,6<br />
1,4<br />
1,2<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
400 O/min<br />
y = -0,0123x + 1,9482<br />
R 2 = 0,9983<br />
0 20 40 60 80 100 120 140 160<br />
Tid [sek]<br />
a) 400 O<br />
min<br />
ln C -C og afbildes som funktion af tiden, se<br />
ln (C-CL)<br />
2,4<br />
2,2<br />
2,0<br />
1,8<br />
1,6<br />
1,4<br />
1,2<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
700 O/min<br />
y = -0,0198x + 1,7529<br />
R 2 = 0,9972<br />
0 20 40 60 80 100 120 140 160<br />
Tid [sek]<br />
b) 700 O<br />
min<br />
Figur 1.5: ln(C – CL) som funktion af tiden ved 400 og 700 O<br />
min .<br />
Udfra hældningen på graferne kan KLa bestemmes, idet -KLa er lig med hældningen, se Tabel<br />
1.3. Det ses af tabellen, at den volumetriske overførselskonstant stiger ved en øget<br />
omrørerhastighed.<br />
Kildehenvisning:<br />
Nomdrejninger<br />
O min <br />
[1] : Biochemical Engineering Fundamentals, 2. udg.<br />
Bailey, James E. og Ollis, David F.<br />
McGraw-Hill Inc. 1986<br />
ISBN 0-07-003212-2<br />
<br />
KLapraksis<br />
[s -1 ]<br />
400 0,0123<br />
700 0,0198<br />
Tabel 1.3: KLapraksis.<br />
[2] : Principles of Fermentation Technology, 2. udg.<br />
Stanbury, P. F.; Whitaker, A. og Hall, S. J.<br />
Elsevier Science Ltd. 1995<br />
ISBN 0-08-036131-5
Bilag 2<br />
Huskelister,<br />
forsøgsbeskrivelser og<br />
resultatskemaer
K-PRO 7 Huskelister Gruppe 2<br />
1. Udførsel af fermenteringerne<br />
Under fermenteringerne er der blevet anvendt forskellige huskelister, forenklede<br />
forsøgsbeskrivelser og resultatskemaer. Disse vil blive gennemgået i dette bilag.<br />
2. Huskelister<br />
Der er udarbejdet forskellige huskelister over hvilke ting der skulle gøres før, under og efter<br />
en fermentering. Disse er som følgende:<br />
2.1. Før fermentering<br />
2.1.1. To dage før fermentering<br />
• Fremstilling af substrat til forkultur<br />
• Podning af forkultur<br />
2.1.2. Dagen før opstart<br />
• Fremstilling af substrat, både tilledningssubstrat og startsubstrat<br />
• Autoklavering af tilledningssubstrat samt flaske til ammoniakvand<br />
• Autoklavering af tildrypningsnåle, gasmus, pipetter samt sterilfilter til<br />
lufttilførsel<br />
• Fremstilling af 2 M saltsyre og 10 % ammoniakvand<br />
• Autoklavering af saltsyre og skumdæmper<br />
• Sterilfiltrering af ammoniakvand<br />
2.1.3. Lige før opstart<br />
• Kalibrering af pH-elektrode<br />
• Fyldning af fermentor med startsubstrat<br />
• Autoklavering af fermentor, se Afsnit 2.1.4<br />
• Påsætning af tildrypningsnåle, gasmus og lufttilførsel<br />
• Fermenteren indstilles, se Afsnit 2.1.5<br />
• Indstilling af kontrolenhed, se Afsnit 2.1.6<br />
• Podning af fermentor, se Afsnit 2.1.7<br />
• Start af dataopsamling, se Afsnit 2.1.8<br />
Bilag 2 Side 1 af 9
K-PRO 7 Huskelister Gruppe 2<br />
2.1.4. Autoklavering af fermentor<br />
• Anbringelse af substrat i fermentor<br />
• Panelet og fermentorens kølevand tændes<br />
• Omrøreren sættes på 700 RPM<br />
• Ventilerne i toppen af fermentoren stilles på: Blå lukket og rød åben.<br />
Rød lukkes ved 100 ºC.<br />
• Temperaturen indstilles på 121 ºC og kontakten ”STER” vælges.<br />
• Temperaturkontakten sættes på ”ACT”.<br />
• Når temperaturen nås, autoklaveres i 20 min.<br />
• Efter endt autoklavering ændres temperaturen til den ønskede temperatur<br />
(30 ºC)<br />
• Konstanten ”STER” sættes på ”CULT”.<br />
• Når temperaturen er nede på 100 ºC, åbnes den blå ventil.<br />
2.1.5. Indstilling af fermentor<br />
• Den blå ventil til luft skal være åben<br />
• Den orange ventil til luft skal være lukket<br />
• Alle åbninger skal være lukkede<br />
• De to sorte aftapningshaner skal være lukkede<br />
• De to røde ventiler skal være lukkede<br />
• STEAM-knappen skal stilles på ”OFF”<br />
• DerskalværeovertrykipH-elektroden(ca.2bar)<br />
• Der skal være kølevand på systemet<br />
Bilag 2 Side 2 af 9
K-PRO 7 Huskelister Gruppe 2<br />
2.1.6. Indstilling af kontrolenhed<br />
• Indstilling kontrolenhed<br />
o POWERskalværepå”ON”<br />
o STER/CULT kontakten skal stå på ”CULT”<br />
o H-OFF/RESET kontakten skal stå på ”H-OFF”<br />
o Kontakten skal stå på ”ON” (grønknap)<br />
• Indstilling af pH-kontrol<br />
o pH indstilles til 5,4<br />
o Displayetskalståpå”ACT”<br />
o AUTO/MAN kontakten skal stå på ”AUTO”<br />
o pH pumperne tændes og stilles på ”STEP”<br />
o ”SPEED” skal stå på 1 streg<br />
• Indstilling af temperaturkontrol<br />
o Temperatur indstilles til 30,0 °C<br />
o Displayetskalståpå”ACT”<br />
o AUTO/MAN kontakten skal stå på ”AUTO”<br />
• Indstilling af substratpumpe<br />
o Substratpumpen skal være slukket<br />
o Signalet til substratpumpen fra PC’en stilles til 0<br />
o Substratpumpen tændes<br />
o Kontakten skal stå på ”REM”<br />
• Indstilling af omrører<br />
o Kontakten skal stå på ”AUTO”<br />
o Setpoint skal stå på 400/700 RPM<br />
o Displayetskalståpå”ACT”<br />
• Indstilling af iltmåler<br />
o Range skal stå på ”HI”<br />
o AUTO/MAN kontakten skal stå på ”MAN”<br />
o Displayetskalståpå”ACT”<br />
L<br />
o Luftflowet skal være 25 min<br />
Bilag 2 Side 3 af 9
K-PRO 7 Huskelister Gruppe 2<br />
2.1.7. Podning af fermentor<br />
• Udpakning af steril pipette<br />
• Flambering af kolbe<br />
• Afpipettering<br />
• Flambering af kolbe<br />
• Flambering af pipettespids og fermentoråbning<br />
• Kulturen hældes i fermentoren<br />
• Fermentoråbningen flamberes og låget sættes i.<br />
2.1.8. Start af dataopsamling<br />
• Start programmet VisSim og åben reguleringsfilen.<br />
• Ændre navnet på den datafil resultaterne gemmes i<br />
• Tryk på ”Run” i menuen ”simulering” eller på ”F5”<br />
• Signalet til substratpumpen indstilles til 0<br />
2.2. Under en fermentering<br />
2.2.1. Prøve udtagning<br />
• Dampgeneratoren tændes ca. 15 min før udtag<br />
• Den røde ventil åbnes, og dampen steriliserer rørene ved udtaget<br />
• Det yderste rør tages af og prøven udtages<br />
• Røret sættes på igen<br />
2.3. Efter en fermentering<br />
2.3.1. Dataopsamling<br />
• For videre bearbejdning af prøven, se afsnit 3<br />
• Programmet VisSim stoppes og gemmes<br />
• Datafilen, hvor de opsamlede data er gemt, omdøbes, således at denne<br />
ikke overskrives<br />
2.3.2. Prøve til kulturrenhed<br />
• Der udtages en prøve på ca. 50 mL i en steril flaske<br />
Bilag 2 Side 4 af 9
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelser Gruppe 2<br />
3. Forsøgsbeskrivelser<br />
3.1. Aflæsning af volumener<br />
• Væskehøjden på alle flasker aflæses<br />
• Resultatet indskrives på resultatskemaerne<br />
3.2. Tørstofbestemmelse<br />
• Tre gange 10,00 mL overføres til centrifugeglas (15 mL) og centrifugeres i 5 min<br />
ved 3500 RPM<br />
• Væsken fjernes, og der efterlades kun cellemasse i bunden af glasset<br />
• Centrifugeglas sættes i varmeskab ved 105 ºC i 1 til 2 døgn<br />
3.3. Bestemmelser med enzymkit<br />
• 10,00 mL overføres til centrifugeglas og centrifugeres ved 3500 RPM i 5 min<br />
• Overdækkes med låg<br />
• Overføres til 80 ºC vandbad i 15 min for at stoppe enzymatiske reaktioner<br />
3.3.1. Sukker<br />
• Prøve klar til glucosetest – kuvette dækkes med låg<br />
• Fremstilling af opløsning 1 og 3<br />
Blank Prøve<br />
Opløsning 3 (37ºC) 0,200 mL<br />
0,200 mL<br />
Prøve<br />
-<br />
0,100 mL<br />
Blandes og placeres i 37 ºC vandbad i 5 min, ne<strong>dk</strong>øles til 20 – 25 ºC<br />
Opløsning 1<br />
1,000 mL<br />
1,000 mL<br />
Dem. vand<br />
1,800 mL<br />
1,700 mL<br />
Blandes og A1 aflæses efter ca. 3 min<br />
Opløsning 2 0,020 mL 0,020 mL<br />
Blandes og A2 aflæses efter 10 – 15 min<br />
Glucose måles efter forsøgsplanen. Blankprøver måles en gang pr. fermentering.<br />
• Glucosemængden omregnes til en sukkermængde<br />
• Resultatet indskrives på resultatskemaerne<br />
Bilag 2 Side 5 af 9
K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelser Gruppe 2<br />
3.3.2. Ethanol<br />
• Prøve klar til ethanoltest – kuvette dækkes med låg<br />
• Fremstilling af opløsning 2<br />
Opløsning 2<br />
Dem. vand<br />
Prøve<br />
Blank Prøvel<br />
3,000 mL<br />
0,100 mL<br />
-<br />
3,000 mL<br />
-<br />
0,100 mL<br />
Blandes og A1 aflæses efter 3 min<br />
Opløsning 3 0,050 mL 0,050 mL<br />
Blandes og A2 måles efter 5 – 10 min<br />
Ethanol måles efter forsøgsplanen. Blankprøve måles en gang pr. fermentering.<br />
• Resultatet indskrives på resultatskemaerne<br />
3.4. Gas analyse<br />
• Gennemluftning af mus – lukning af mus<br />
• Udtagning af prøve<br />
• Kørsel på GC – trippelbestemmelse<br />
Bilag 2 Side 6 af 9
K-PRO 7 Resultatskemaer Gruppe 2<br />
4. Resultatskemaer<br />
4.1. Fermentering<br />
Dato:<br />
Forsøgsnr.:<br />
Fermenteringstype:<br />
4.2. Podemængde<br />
Podemængde [g]:<br />
Podemængde [mL]:<br />
Koncentration podekolbe [g/L]:<br />
Pladeudspredning:<br />
Plade:<br />
Forbrug af tilledte væsker:<br />
Ammoniakvandforbrug [mL]:<br />
Saltsyreforbrug [mL]:<br />
Substratforbrug [L]<br />
Skema til prøveudtagning:<br />
Se vedlagte sider<br />
Bilag 2 Side 7 af 9
K-PRO 7 Resultatskemaer Gruppe 2<br />
4.3. Skema til prøveudtagning 1<br />
Fermentering nr.:<br />
Dato:<br />
Tørstof<br />
Ethanol Sukker<br />
1 2 3<br />
Prøve nr. Før Efter Før Efter Før Efter FF Abs FF Abs<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
8<br />
9<br />
10<br />
11<br />
12<br />
13<br />
14<br />
15<br />
Forkultur - - - -<br />
Bilag 2 Side 8 af 9
K-PRO 7 Resultatskemaer Gruppe 2<br />
4.4. Skema til prøveudtagning 2<br />
Fermentering nr.:<br />
Dato:<br />
4.5. Væskeforbrug GC<br />
Prøve nr. Substrat Ammoniakvand Saltsyre 1 2 3<br />
Start - - -<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
8<br />
9<br />
10<br />
11<br />
12<br />
13<br />
14<br />
15<br />
Bilag 2 Side 9 af 9
Bilag 3<br />
Bestemmelse af<br />
sukkerindhold
K-PRO 7 Bestemmelse af sukkerindhold Gruppe 2<br />
1 Bestemmelse af sukkerindhold<br />
Glucoseinholdet i fermenteringsvæske er bestemt vha. Enzymatisk bioanalyse nr. 139041 fra<br />
Boehringer Mannheim vha. spektrofotometer, hvorefter denne koncentration omregnes til en<br />
sukkerkoncentration. Dette beskrives i nedenstående afsnit. Herudover er kendte og<br />
beregnede koncentrationer af sukker sammenlignet for at undersøge, hvor effektiv<br />
enzymkittet er til at genfinde en kendt sukkerkoncentration, når der efter bestemmelse af<br />
glucoseindholdet foretages en omregning. Derudover undersøges om den anvendte<br />
bølgelængde ved analyserne er den optimale.<br />
1.1 Bestemmelse af glucoseindhold i fermenteringsvæske<br />
Det enzymatiske kit gør det muligt at finde indholdet af glucose i fermenteringsvæske ved<br />
først at spalte sukker til glucose ved enzymatisk inversion og derefter omdanne glucose til Dgluconat-6-phopshat.<br />
1.1.1 Enzymatisk inversion<br />
Ved pH 4,6 hydrolyseres sukker, her som sucrose, til fructose og glucose vha. enzymet β-<br />
fructosidase<br />
12<br />
22<br />
11<br />
2<br />
β−fructosida<br />
se<br />
C H O + H O ⎯⎯⎯⎯⎯→<br />
D − C H O + D − C<br />
6 Glucose<br />
6 Fructose<br />
Ved nedbrydningen af sucrose er der kun glucose og fructose tilstede i prøven, derved er det<br />
muligt at bestemme den totale mængde glucose tilstede i prøven.<br />
1.1.2 Glucosebestemmelse<br />
Ved pH 7,6 katalyserer tilstedeværelsen af enzymet hexokinase (HK) phosphoryleringen af<br />
D-glucose med ATP.<br />
O<br />
H OH<br />
HOH H OH<br />
H OH<br />
OH<br />
D-Glucose<br />
+ ATP<br />
HK<br />
Bilag 3 Side 1 af 5<br />
6<br />
O<br />
H<br />
12<br />
HO<br />
H<br />
H<br />
OH<br />
O<br />
H<br />
O<br />
OH<br />
P<br />
OH<br />
O -<br />
O -<br />
6<br />
H<br />
12<br />
O<br />
+ ADP<br />
Glucose-6-phosphat
K-PRO 7 Bestemmelse af sukkerindhold Gruppe 2<br />
Det dannede glucose-6-phosphat oxideres herefter vha. NADP + ved tilstedeværelse af<br />
enzymet<br />
NADPH.<br />
glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6P-DH) til D-gluconat-6-phopshat og<br />
O<br />
H<br />
HO<br />
H<br />
H<br />
OH<br />
O<br />
H<br />
O<br />
OH<br />
P<br />
OH<br />
O -<br />
O -<br />
+<br />
Glucose-6-phosphat<br />
NADP +<br />
G 6 P-DH<br />
NADPH H +<br />
Bilag 3 Side 2 af 5<br />
O<br />
H<br />
HO<br />
OH<br />
H<br />
H<br />
OH<br />
O<br />
H<br />
O<br />
OH<br />
P<br />
OH<br />
O -<br />
O -<br />
D-gluconat-6-phosphat<br />
+ +<br />
Den mængde NADPH, som dannes ved denne reaktion, vil støkiometrisk være lig med<br />
mængden af D-glucose omdannet, og derfor kan NADPH anvendes som et mål for<br />
tilstedeværelsen af glucose og måles ved spektrofotometri, da denne absorberer lys.<br />
1.1.3 Prøveforberedelse<br />
En prøve udtaget fra fermentoren centrifugeres og placeres overdækket i et 80 ºC varmt<br />
vandbad i 15 min for at stoppe enzymatiske reaktioner, og herefter kan væsken anvendes til<br />
måling af glucoseindholdet. Prøven fortyndes, hvis dette er nødvendigt.<br />
1.1.4 Reagensfremstilling<br />
7,2 g pulverblanding (triethanolamin buffer, 110 mg NADP, 260 mg ATP og MgSO4) (pH ca.<br />
7,6) opløses i 45 mL dem. vand, hvilket danner opløsning 1. Opløsning 2 indeholder 1,1 mL<br />
enzymopløsning (320 U hexokinase og 160 U G6P-DH). 0,5 g lyophilizat (citrat buffer, pH<br />
4,6 og 720 U β-fructosidase) opløses i 10 mL dem. vand, hvilket danner opløsning 3.<br />
1.1.5 Måling af glucose-indholdet<br />
Der udtages 0,200 mL af opløsning 3 opvarmet til 37ºC og 0,100 mL af prøven, disse blandes<br />
og inkuberes ved 37ºC i 5 min, herved den enzymatiske inversion sker. Derefter tilsættes<br />
1,000 mL af opløsning 1 og henholdsvis 1,700 mL dem. vand i prøveopløsningen og 1,800<br />
mL dem. vand i blankprøven. Dette blandes, og efter 3 min kan absorbansen A1 aflæses.
K-PRO 7 Bestemmelse af sukkerindhold Gruppe 2<br />
Inversionsreaktionen startes ved at tilsætte 0,020 mL af opløsning 2 og en opblanding. Efter<br />
10 – 15 min er reaktionen endt, og absorbansen A2 kan aflæses.<br />
Herefter er det muligt at bestemme den totale mængde glucose tilstede i prøven:<br />
∆A<br />
Glucose<br />
= ( A 2 − A1<br />
) Prøve − ( A 2 − A1<br />
) Blank<br />
1.1.6 Beregning af koncentrationen af glucose i fermenteringsvæsken<br />
Prøverne måles på et spektrofotometer ved 340 nm og 20 – 25 ºC, hvorudfra det er muligt at<br />
beregne koncentrationen af glucose i prøven udfra nedenstående ligning. Det er ifølge<br />
g<br />
forskriften muligt at måle koncentrationer indenfor intervallet 8<br />
L prøve<br />
være overdækket for at undgå afdampning.<br />
V ⋅M<br />
c = ⋅∆A<br />
Slut Glucose<br />
Glucose mmol<br />
ε340nm ⋅ dKuvette ⋅vPrøve⋅1000 mol<br />
Glucose<br />
hvor VSlut : Slutvolumen af prøve [mL]<br />
vPrøve : Volumen prøve tilsat [mL]<br />
dKuvette : Lysvej gennem kuvette [cm]<br />
glucose g glucose<br />
0, - L prøve<br />
80 . Prøven bør<br />
6, 3 ] ⋅<br />
ε340 nm : Molær absorptionskoefficient for NADPH ved 340 nm [ L<br />
mmol cm<br />
1.1.7 Beregning af sukkerindhold<br />
Ved fermenteringerne anvendes sukker, som hovedsageligt består af sucrose, der så nedbrydes<br />
til glucose og fructose. Indholdet af sukker i fermenteringsvæsken måles som mængden af<br />
glucose, hvorfor det er nødvendigt at omregne de fundne glucosekoncentrationer til<br />
sukkerkoncentrationer.<br />
For at kunne omregne glucosekoncentrationer til sukkerkoncentrationer er forholdet mellem<br />
glucose og sukker fundet udfra nedenstående ligning:<br />
12<br />
22<br />
11<br />
2<br />
β−fructosida<br />
se<br />
C H O + H O ⎯⎯⎯⎯⎯→<br />
D − C H O + D − C<br />
6 Glucose<br />
6 Fructose<br />
Her ses, at molforholdet mellem glucose og sukker er 1:1, hvorfor det er muligt at beregne<br />
masseforholdet, se Tabel 1.1, og derved beregne sukkerkoncentrationerne.<br />
Bilag 3 Side 3 af 5<br />
6<br />
12<br />
6<br />
H<br />
12<br />
O
K-PRO 7 Bestemmelse af sukkerindhold Gruppe 2<br />
Glucose Sukker<br />
CH 6 12O6 C12H22O11 M<br />
g<br />
<br />
<br />
mol 180,2 342,3<br />
n [mol] 1 1<br />
m [g] 180,2 342,3<br />
forhold<br />
g sukker<br />
gglucose<br />
gglucose<br />
g sukker<br />
1<br />
0,526<br />
1,901<br />
1<br />
Tabel 1.1: Forhold mellem glucose og sukker.<br />
Når dette forhold kendes, er det muligt at beregne koncentrationen af sukker udfra<br />
koncentrationen af glucose.<br />
1.2 Sammenligning af kendte og beregnede sukkerkoncentrationer<br />
For at evaluere resultaterne ved anvendelse af enzymkit til bestemmelse af koncentrationen af<br />
sukker i fermenteringsvæsken fremstilles en række standardopløsninger indeholdende en<br />
kendt mængde sukker. Herefter måles disse på spektrofotometer ved 340 nm og udfra<br />
absorbanserne er det muligt at beregne koncentrationen af glucose i prøven, som herefter kan<br />
omregnes til sukker. Den beregnede koncentration kan herefter sammenlignes med den kendte<br />
koncentration, og herudfra kan det vurderes om enzymkittet er anvendeligt til bestemmelse af<br />
sukkerkoncentrationen i fermenteringsvæske.<br />
1.2.1 Standardopløsninger<br />
Der blev fremstillet otte standardopløsninger i intervallet 0,1 til 30 g sukker pr. liter. De<br />
aktuelle koncentrationer og de beregnede koncentrationer ses i Tabel 1.2.<br />
Opløsning<br />
nr.<br />
Caktuel<br />
[ g<br />
L ]<br />
Cberegnet<br />
[ g<br />
L ]<br />
1 0,1017 0,098<br />
2 0,5019 0,459<br />
3 1,0121 1,148<br />
4 2,5062 2,461<br />
5 5,0330 5,250<br />
6 10,0100 9,843<br />
7 20,2470 19,686<br />
8 30,8510 47,574<br />
Tabel 1.2: Aktuelle og beregnede koncentrationer af standardopløsninger.<br />
Den beregnede koncentration er herefter afbildet som funktion af den aktuelle koncentration,<br />
se Figur 1.1, derudover er der indsat en kurve til sammenligning af den aktuelle og den<br />
beregnede koncentration. Det er tydeligt at se de steder, hvor de beregnede koncentrationer<br />
ikke stemmer overens med de aktuelle.<br />
Bilag 3 Side 4 af 5
K-PRO 7 Bestemmelse af sukkerindhold Gruppe 2<br />
Beregnet koncentration [g/L]<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50<br />
Aktuel koncentration [g/L]<br />
Sukker<br />
Figur 1.1: Den beregnede koncentration som funktion af den aktuelle koncentration.<br />
Som det ses af Figur 1.1, så afviger den beregnede koncentration meget fra den aktuelle ved<br />
koncentrationer højere end 20 g<br />
L , dette kan skyldes en fejl ved målingerne, da der kun er<br />
foretaget en gentagelse. Det ses dog, at de beregnede koncentrationer under 10 g<br />
L<br />
passer godt<br />
med de aktuelle koncentrationer, hvorfor ligningen til beregning af koncentrationen kan<br />
anvendes, se Afsnit 1.1.6.<br />
1.3 Bestemmelse af optimal bølgelængde<br />
Bølgelængden 340 nm anvendes til bestemmelse af glucosekoncentrationen. Denne<br />
bølgelængde er valgt på baggrund af en bølgelængdescanning for at finde den optimale<br />
bølgelængde til analyse af glucosekoncentrationen i prøverne, se Figur 1.2. Værdien er valgt,<br />
da der ved 340 nm er en høj absorbans, men dog ikke så høj en absorbans, at prøven<br />
absorberer alt lyset, se Figur 1.2.<br />
Abs<br />
7,0<br />
6,0<br />
5,0<br />
4,0<br />
3,0<br />
2,0<br />
1,0<br />
0,0<br />
Glucose<br />
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440<br />
Bølgelængde [nm]<br />
Figur 1.2: Absorbans som funktion af bølgelængde for glucose.<br />
Bilag 3 Side 5 af 5
Bilag 4<br />
Bestemmelse af<br />
ethanolindhold
K-PRO 7 Bestemmelse af ethanolindhold Gruppe 2<br />
1 Bestemmelse af ethanolindhold<br />
Ethanolinholdet i fermenteringsvæske er bestemt vha. Enzymatisk bioanalyse nr. 176290 fra<br />
Boehringer Mannheim vha. spektrofotometer, hvilket beskrives i nedenstående afsnit.<br />
Herudover er kendte og beregnede koncentrationer af ethanol sammenlignet for at undersøge,<br />
hvor effektiv enzymkittet er til at genfinde en kendt ethanolkoncentration. Derudover<br />
undersøges om den anvendte bølgelængde ved analyserne er den optimale.<br />
1.1 Bestemmelse af ethanolindhold i fermenteringsvæske<br />
Det enzymatiske kit fra Boehringer Mannheim virker ved, at ethanol oxideres til acetaldehyd<br />
af nicotinamid-adenin dinuleotid (NAD) ved tilstedeværelse af enzymet alkohol<br />
dehydrogenase (ADH):<br />
+ ADH<br />
CH 3CH<br />
2OH<br />
NAD ⎯⎯<br />
⎯ → CH 3<br />
+ CHO + NADH + H<br />
Ligevægten vil under alkaline forhold forskydes mod højre, og derved omdannes alt ethanol i<br />
prøven til acetaldehyd. Acetaldehyd oxideres herefter til eddikesyre ved tilstedeværelse af<br />
aldehyd dehydrogenase (Al-DH):<br />
+<br />
Al−DH<br />
CH3CHO NAD + H 2O<br />
⎯⎯⎯→<br />
CH 3CH<br />
2<br />
+ OH + NADH + H<br />
Udfra de to ovenstående reaktionsligninger ses, at der dannes 2 mol NADH for hver gang der<br />
dannes 1 mol ethanol. Da det er NADH, der måles ved denne bestemmelse på<br />
spektrofotometeret, skal der tages højde for dette forhold mellem ethanol og NADH i<br />
beregningen af ethanolkoncentrationen, se nedenstående formel.<br />
1.1.1 Prøveforberedelse<br />
En prøve udtaget fra fermentoren centrifugeres og placeres overdækket i et 80 ºC varmt<br />
vandbad i 15 min for at stoppe enzymatiske reaktioner, og herefter kan væsken anvendes til<br />
måling af ethanolindholdet. Prøven fortyndes, hvis dette er nødvendigt.<br />
Bilag 4 Side 1 af 4<br />
+<br />
+
K-PRO 7 Bestemmelse af ethanolindhold Gruppe 2<br />
1.1.2 Reagensfremstilling<br />
3,000 mL kalium diphosphatbuffer (pH ca. 9) blandes med 1 tablet (ca. 4 mg NAD og 0,8 U<br />
Al-DH) og danner opløsning 2. Denne blanding tilsættes 0,100 mL udtaget prøve eller dem.<br />
vand. Efter grundig omrystning måles absorbansen A1. Oxidationsreaktion sættes i gang ved<br />
at tilsætte 0,050 mL ADH (opløsning 3). Efter 5 – 10 min måles absorbansen A2.<br />
1.1.3 Beregning af koncentrationen af ethanol i fermenteringsvæsken<br />
Prøven måles på et spektrofotometer ved 340 nm og 20 ºC, hvorudfra det er muligt at beregne<br />
koncentrationen af ethanol i prøven. Det er ifølge forskriften muligt at måle koncentrationer<br />
g ethanol g ethanol<br />
indenfor intervallet 0, 06 − 60 . Prøven skal være overdækket for at undgå<br />
L prøve L prøve<br />
afdampning af ethanol.<br />
hvor<br />
V ⋅ M<br />
c Ethanol =<br />
⋅<br />
Prøve −<br />
ε ⋅ d<br />
⋅1000<br />
VSlut<br />
340 nm<br />
Slut Ethanol<br />
NADH<br />
Kuvette ⋅ v Prøve ⋅ 2<br />
Ethanol<br />
: Slutvolumen af prøve [mL]<br />
vPrøve : Volumen prøve tilsat [mL]<br />
dKuvette : Lysvej gennem kuvette [cm]<br />
( A 2 − A1<br />
) − ( A 2 A1<br />
) Blank<br />
Bilag 4 Side 2 af 4<br />
mmol<br />
mol<br />
6, 3 ] ⋅<br />
ε340 nm : Molær absorptionskoefficient for NADH ved 340 nm [ L<br />
mmol cm<br />
1.2 Sammenligning af kendte og beregnede ethanolkoncentrationer<br />
For at evaluere resultaterne ved anvendelse af enzymkit til bestemmelse af koncentrationen af<br />
ethanol i fermenteringsvæsken fremstilles en række standardopløsninger indeholdende en<br />
kendt mængde ethanol. Herefter måles disse på spektrofotometer ved 340 nm og udfra<br />
absorbanserne er det muligt at beregne koncentrationen af ethanol i prøven. Den beregnede<br />
koncentration kan herefter sammenlignes med den kendte koncentration, og herudfra kan der<br />
vurderes, hvor godt enzymkittet kan genfinde en kendt mængde ethanol.
K-PRO 7 Bestemmelse af ethanolindhold Gruppe 2<br />
1.2.1 Standardopløsninger<br />
Der blev fremstillet otte standardopløsninger i intervallet 0,1 g<br />
L<br />
g<br />
til 30 L . De aktuelle<br />
koncentrationer og de senere beregnede koncentrationer samt afvigelsen ses i Tabel 1.1.<br />
Opløsning<br />
nr.<br />
Caktuel<br />
[ g<br />
L ]<br />
Cberegnet<br />
[ g<br />
L ]<br />
1 0,1055 0,092<br />
2 0,4860 0,411<br />
3 0,9980 1,014<br />
4 2,7460 2,500<br />
5 5,2620 5,288<br />
6 11,1520 10,253<br />
7 20,4500 20,736<br />
8 31,9800 37,094<br />
Tabel 1.1: Aktuelle og beregnede koncentrationer af standardopløsninger.<br />
Den beregnede koncentration er herefter afbildet som funktion af den aktuelle koncentration,<br />
se Figur 1.1, derudover er der indsat en kurve til sammenligning af kendte og beregnede<br />
koncentrationer, så det er tydeligt at se de steder, hvor de beregnede koncentrationer ikke<br />
stemmer overens med de aktuelle.<br />
Beregnet koncentration [g/L]<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50<br />
Aktuel koncentration [g/L]<br />
Ethanol<br />
Figur 1.1: Den beregnede koncentration som funktion af den aktuelle koncentration.<br />
Bilag 4 Side 3 af 4
K-PRO 7 Bestemmelse af ethanolindhold Gruppe 2<br />
Som det ses af Figur 1.1, så afviger den beregnede koncentration meget fra den aktuelle ved<br />
koncentrationer højere end 20 g<br />
L , dette kan skyldes en fejl ved målingerne, da der kun er<br />
foretaget en gentagelse. Det ses dog, at de beregnede koncentrationer under 10 g<br />
L<br />
passer godt<br />
med de aktuelle koncentrationer, hvorfor ligningen til beregning af koncentrationen kan<br />
anvendes, se Afsnit 1.1.3.<br />
1.3 Bestemmelse af optimal bølgelængde<br />
Som nævnt måles absorbansen ved anvendelse af enzymkit ved 340 nm. Denne bølgelængde<br />
er valgt efter at have foretaget en bølgelængdescanning, se Figur 1.2, for at finde den<br />
optimale bølgelængde, hvor der opnås en høj absorbans samtidig med at det undgås at prøven<br />
absorperer alt lyset.<br />
Bølgelængden 340 nm er valgt, da der her er en høj absorbans, men denne ligger alligevel et<br />
stykke fra, hvor alt lyset bliver absorberet, se Figur 1.2.<br />
Abs<br />
Ethanol<br />
7,0<br />
6,0<br />
5,0<br />
4,0<br />
3,0<br />
2,0<br />
1,0<br />
0,0<br />
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440<br />
Bølgelængde [nm]<br />
Figur 1.2: Absorbans som funktion af bølgelængden for ethanol.<br />
Bilag 4 Side 4 af 4
Bilag 5<br />
Bestemmelse af nitrogen og<br />
kuldioxid
K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2<br />
1 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid<br />
Koncentrationen af nitrogen og kuldioxid i udgangsgassen er bestemt ved anvendelse af<br />
gaschromatografi. Denne analysemetode er beskrevet i nedenstående. Herudover er der<br />
fremstillet standar<strong>dk</strong>urver for både nitrogen og kuldioxid, og disse er undersøgt vha.<br />
regressionsanalyse.<br />
1.1 Gaschromatografi<br />
Gaschromatografi (GC) er en chromatografisk metode, hvor en blanding separeres ved først at<br />
bringe stofferne i blandingen på gasform og dernæst lade dem passere igennem en kolonne.<br />
Gaschromatografi kan inddeles i to chromatograferingstyper, GLC og GSC, hvor GLC står<br />
for Gas Liquid Chromatografi og GSC for Gas Solid Chromatografi. Forskellen mellem de to<br />
metoder er, ved GLC foregår separationen af blandingens komponenter pga.<br />
ligevægtsfordelingen mellem en flydende stationærfase og bæregassen. Hvor blandingens<br />
komponenter ved GSC adskilles pga. deres affinitet 1 til en fast stationær fase. [1], [2]<br />
1.1.1 Apparatet<br />
Et GC-apparat er grundlæggende opbygget af fem enheder. Tilførsel af bæregas, en injektor,<br />
en ovn, en kolonne og en detektor, se Figur 1.1. Bæregassen har til formål at bære prøven<br />
igennem systemet, hvorfor det er vigtigt at bæregassen er inert, således at den ikke påvirker<br />
prøven. Af denne grund anvendes ofte N2,H2 eller He som bæregas. Injektoren har til formål<br />
at føre prøven over i bæregassen. Der findes forskellige typer af injektionssystemer, de<br />
vigtigste er split, hvor prøven splittes op i to strømme, hvoraf kun den ene føres ind gennem<br />
kolonnen, eller splitless, hvor hele prøven sendes ind gennem kolonnen. Ovnen holder<br />
temperaturen gennem kolonnen. De fleste ovne kan programmeres således, at temperaturen<br />
kan varieres under analysen, så kolonnen får optimale temperaturforhold. I kolonnen foregår<br />
selve adskillelsen af de forskellige komponenter i prøven. Kolonnen kan enten være en pakket<br />
eller en kapillar kolonne. Detektoren er den del af apparatet der skal registrere, hvornår de<br />
separerede komponenter i prøven passerer ud af kolonnen. Detektoren sender et signal videre<br />
til et databehandlingssystem, som ender ud med et chromatogram. [1], [2]<br />
1 Stoffers evne til at bindes til den stationære fase.<br />
Bilag 5 Side 1 af 9
K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2<br />
Figur 1.1: Opbygning af GC[2].<br />
1.2 Måling af nitrogen og kuldioxid<br />
Til måling af nitrogen og kuldioxid anvendes en gaschromatograf af mærket Hewlett Packard<br />
HP 6390 serie GC system Plus+.<br />
1.2.1 Bæregas<br />
Som bæregas anvendes helium med et flow på 4 mL<br />
cm<br />
, eller en gas hastighed på 52 .<br />
min s<br />
En af fordelene ved at anvende He som bæregas er, at den er velegnet til TCD, da den har en<br />
varmekonduktivitet, der er højere en de fleste almindelige gasser, der analyseres for. Dette gør<br />
detektoren mere følsom over for komponenter i prøven, se Afsnit 1.2.5.<br />
1.2.2 Injektion<br />
Injektionen foregår manuelt i en split injektionsblok. Prøven, der injiceres, har et volumen på<br />
50 µL og da der anvendes et splitforhold på 1:50, vil 1 µL prøve føres til kolonnen. Prøven<br />
opvarmes til 200 °C, inden den sendes ind gennem kolonnen.<br />
1.2.3 Kolonne<br />
Den anvendte kolonne er en GS-GASPRO kolonne, som hører under kategorien PLOT<br />
kolonner (Porous Layer Open Tubular). Kolonnen er en kapillar kolonne med en fast<br />
stationær fase, der består af Fused Silica 2 , hvilket gør det til en GSC adskillelse.<br />
Selve kolonnen er 30 m lang og har en indvendig diameter på 0,32 mm.<br />
2<br />
Fused Silica er SiO2 uden krystallinsk struktur, ligner ikke glas og er et ikke krystallinsk fast stof, og er i høj<br />
grad amorf (stor atomuorden), har samme karakteristika som en væske [3].<br />
Bilag 5 Side 2 af 9
K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2<br />
1.2.4 Ovn<br />
Ovnen skal ifølge metoden, se Figur 1.4, programmeres til at holde en temperatur på 25 °C i 3<br />
min. og herefter øges temperaturen med 10 °C<br />
min. til200°C.MendaN2 og CO2 har korte<br />
retentionstider, se Figur 1.4 og dermed hurtig kommer ud af kolonnen, afkortes programmet<br />
til en stigning på 10 °C til 100 °C. Herudover blev starttemperaturen hævet fra 25 °C til 30<br />
min.<br />
°C. Dette skyldes, at ovnen blev kølet med luft fra laboratoriet og da rumtemperaturen ofte<br />
var over 25 °C, var det ikke muligt at køle til denne temperatur.<br />
1.2.5 Detektor<br />
Den detektor, der anvendes, er en termisk ledningsevne detektor (TCD), som er en detektor<br />
der består af to kamre, hvor der i hvert af kamrene sidder en wolframglødetråd, se Figur 1.2. I<br />
det ene kammer løber prøven og bæregassen igennem, hvor der i det andet kammer løber ren<br />
bæregas. Alle stoffer har forskellige varmeledningsevne, hvilket betyder at når et stof fra<br />
prøven passerer det ene kammer sammen med bæregassen, ændres temperaturen af<br />
glødetråden, som følge af ændringen i varmeledningsevnen. Denne ændring i temperatur<br />
forsager en ændring af modstanden over glødetråden, som så omsættes til et signal. [1], [2]<br />
Figur 1.2: Opbygning af en TCD detektor [1].<br />
Helium er den mest anvendte bæregas, når der anvendes en TCD detektor. Helium har en<br />
varmekonduktivitet, der er højere de fleste andre gasser, kun hydrogen har en højere værdi, se<br />
Figur 1.3. Dette betyder, at He kan anvendes som bæregas gennem detektoren til analyse af<br />
alle andre gasser end He og H2. I forhold til gasserne i prøven har He en stor<br />
varmeledningsevne, hvilket gør det lettere at detektere et fremmed stof, og dermed bliver<br />
detektoren mere følsom [1], [2].<br />
Bilag 5 Side 3 af 9
K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2<br />
Stof λ W mK ⋅ <br />
Stof λ W mK ⋅ <br />
H2 0,183 Ar 0,017<br />
He 0,148 Ne 0,048<br />
N2 0,026 NO 0,025<br />
CO2 0,016 Cl2 0,009<br />
H2O 0,017 SO2 0,008<br />
O2 0,026 H2S 0,012<br />
CH4 0,033 NH3 0,024<br />
C2H6 0,021 CO 0,025<br />
Figur 1.3: Varmeledningsevne for forskellige gasser [4].<br />
Figur 1.4: Metode [5]<br />
Ved at følge den metode, der er angivet på Figur 1.4, fås et chromatograf pr. prøve, for<br />
talværdier, se Måledata 1 til 6. Eksempler på chromatogrammer er vedlagt bagest i dette bilag.<br />
Bilag 5 Side 4 af 9
K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2<br />
1.3 Måling af kuldioxid<br />
Til måling af kuldioxid er der fremstillet en standar<strong>dk</strong>urve ud fra to kendte gasblandinger, ren<br />
CO2 og atmosfærisk luft. Fra GC målinger fås følgende arealer, se Tabel 1.1.<br />
Konc. Arealer<br />
% 1 2 3 snit<br />
Ren CO2 99,95 483 477 526 495<br />
Atmosfærisk luft 0,0365 0,311 0,341 0,195 0,282<br />
Tabel 1.1: Målinger til standar<strong>dk</strong>urve for kuldioxid.<br />
Indtegnes dette fås følgende standar<strong>dk</strong>urve, se Figur 1.5.<br />
Konc %<br />
100<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
CO2<br />
Konc % = 0,202·Areal - 0,021<br />
R 2 =0,996<br />
0 100 200 300 400 500<br />
Areal<br />
Figur 1.5: Standar<strong>dk</strong>urve for kuldioxid.<br />
Denne standar<strong>dk</strong>urve vil blive brugt til bestemmelse af kuldioxi<strong>dk</strong>oncentrationen i<br />
udgangsgassen under fermenteringerne.<br />
Bilag 5 Side 5 af 9
K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2<br />
1.3.1 Regressionsanalyse for kuldioxid<br />
Der ses, om der er statistisk grundlag for at anvende den lineære model.<br />
Konc Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse<br />
-----------------------------------------------<br />
0,0365 3 0,3 -21,139 21,704<br />
99,95 3 495,3 473,912 516,755<br />
-----------------------------------------------<br />
Konc Antal Snit Homogene grupper<br />
-----------------------------------------------<br />
0,0365 3 0,3 X<br />
99,95 3 495,3 X<br />
-----------------------------------------------<br />
Figur 1.6: Variansanalyse for standar<strong>dk</strong>urver til kuldioxid analyse.<br />
Det ses af Figur 1.6, at der er signifikant forskel mellem målinger på de forskellige<br />
koncentrationer, hvilket der skal være for at analysemetoden kan detektere forskelle<br />
mellem de forskellige koncentrationer.<br />
Konc %<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0 100 200 300 400 500 600<br />
Areal<br />
[%] = 0,202 · Areal – 0,021<br />
P-værdi = 0,000<br />
Figur 1.7: Regressionsanalyse for kuldioxid standar<strong>dk</strong>urven.<br />
Det ses af Figur 1.7, at det er rimelig at anvende den lineære model til målingerne indenfor<br />
et 95 % konfidensinterval, da P-værdien er mindre end 0,05.<br />
Bilag 5 Side 6 af 9
K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2<br />
1.4 Måling af nitrogen<br />
Til måling af nitrogen er der fremstillet en standar<strong>dk</strong>urve ud fra tre kendte gasblandinger, ren<br />
N2, atmosfærisk luft og ren CO2. Fra GC målinger fås følgende arealer, se Tabel 1.2.<br />
Konc. Arealer<br />
% 1 2 3 snit<br />
Ren N2 99,996 473 489 462 475<br />
99,996 498 461 473 477<br />
Atmosfærisk luft 78,084 408 419 409 412<br />
78,084 400 434 400 411<br />
Ren CO2 0,0005 3,568 3,547 2,023 3,046<br />
Tabel 1.2: Målinger til standar<strong>dk</strong>urve for nitrogen.<br />
Indtegnes dette fås følgende standar<strong>dk</strong>urve, se Figur 1.8.<br />
Konc %<br />
100<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
N2<br />
Konc % = 0,205·Areal - 1,890<br />
R 2 = 0,985<br />
0 100 200 300 400 500<br />
Areal<br />
Figur 1.8: Standar<strong>dk</strong>urve for nitrogen.<br />
Denne standar<strong>dk</strong>urve vil blive brugt til bestemmelse af nitrogenkoncentrationen i<br />
udgangsgassen under fermenteringerne.<br />
Bilag 5 Side 7 af 9
K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2<br />
1.4.1 Regressionsanalyse for nitrogen<br />
Der ses om der er statistisk grundlag for at anvende den lineære model.<br />
Konc Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse<br />
-----------------------------------------------<br />
0,0005 3 3,4 -7,863 14,741<br />
78,084 6 411,7 403,675 419,659<br />
99,996 6 476,0 468,008 483,992<br />
-----------------------------------------------<br />
Konc Antal Snit Homogene grupper<br />
-----------------------------------------------<br />
0,0005 3 3,4 X<br />
78,084 6 411,7 X<br />
99,996 6 476,0 X<br />
-----------------------------------------------<br />
Figur 1.9: Variansanalyse for standar<strong>dk</strong>urver til nitrogenanalyse.<br />
Det ses af Figur 1.9, at der er signifikant forskel mellem målinger på de forskellige<br />
koncentrationer, hvilket der skal være for at analysemetoden kan detektere forskelle<br />
mellem de forskellige koncentrationer.<br />
Konc %<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0 100 200 300 400 500<br />
Areal<br />
[%] = 0,205 · Areal – 1,890<br />
P-værdi = 0,000<br />
Figur 1.10: Regressionsanalyse for nitrogen standar<strong>dk</strong>urven.<br />
Det ses af Figur 1.10, at det er rimelig at anvende en lineære model til målingerne inden<br />
for et 95 % konfidensinterval, da P-værdien er mindre end 0,05.<br />
Bilag 5 Side 8 af 9
K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2<br />
1.5 Litteraturhenvisning<br />
[1] : Gas Chromatografi, 2. udgave<br />
Fowlis, Ian A.<br />
John Wiley & Sons Ltd. UK 1995<br />
ISBN 0-471-95468-3<br />
[2] : Apparatteknik – 3. udgave<br />
Simonsen, Flemming<br />
Akademisk Forlag, DK 1997<br />
ISBN 87-500-3503-7<br />
[3] : Materials Science and Engineering – An Introduction, 5. udgave<br />
Callister, William D. Jr.<br />
John Wiley & Sons Inc. 2000<br />
ISBN 0-471-32013-7<br />
[4] : Databog fysik kemi – 8. udgave<br />
Andersen, E. S., Jespergaard, P. og Østergaard, O. G.<br />
F & K forlaget, DK 1994<br />
ISBN 87-87229-55-2<br />
[5] : http://www.chem.agilent.com/cag/cabu/pdf/c531.pdf (28/11-03)<br />
Bilag 5 Side 9 af 9
Bilag 6<br />
Anvendt statistik
K-PRO 7 Anvendt statistik Gruppe 2<br />
Anvendt statistik<br />
I det følgende beskrives de statistiske metoder, der er anvendt til vurdering af standar<strong>dk</strong>urver<br />
til gaschromatografiske målinger samt tørstofmålinger. Vurderingen af standar<strong>dk</strong>urver er<br />
foretaget ud fra en regressionsanalyse. Til tørstofmålingerne er anvendt en variansanalyse,<br />
hvor det undersøges, om der er signifikant forskel mellem de forskellige prøveudtagninger.<br />
Begge analysetyper er foretaget vha. statistikprogrammet STATGRAPHICS Plus, og ser ud<br />
som følgende.<br />
Regressionsanalyse<br />
For at undersøge hvor godt en tilnærmet linie beskriver en dataserie kan der foretages en<br />
regressionsanalyse. En sådan ser ud som følgende:<br />
Y<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
Forklaring til regressionsanalyse<br />
0 2 4 6 8 10<br />
Bilag 6 Side 1 af 3<br />
X<br />
Y = 1,004·X + 0,067<br />
P-værdi: 0,000<br />
Figur 1: Regressionsanalyse for en tilfældig dataserie.<br />
Den blå linie på Figur 1, angiver den bedste linie gennem værdierne i dataserien. De orange<br />
linier angiver konfidensgrænserne, som beskriver sandsynligheden for at gennemsnittet for en<br />
fremtidig dataserie ligger inden for disse grænser. Normalt vælges konfidensniveauet til 0,95.<br />
Dvs. at en fremtidig måleserie med 95 % sandsynlighed ligger indenfor disse grænser. De<br />
violette linier angiver prædiktionsgrænserne. Normalt vælges prædiktionsniveauet til 0,95.<br />
Dvs. at én fremtidig værdi med 95 % sandsynlighed ligger indenfor disse grænser.
K-PRO 7 Anvendt statistik Gruppe 2<br />
Når konfidens- og prædiktionsniveauerne er sat til 0,95; medfører dette, at der er 5 %<br />
sandsynlighed for at forkaste en værdi, selvom den er sand med den fundne model.<br />
Sandsynligheden for at forkaste en værdi, selvom den er sand, kan beskrives med en Pværdi.<br />
Hvis konfidens- og prædiktionsniveauer er valg til 0,95, ønskes en P-værdi < 0,05.<br />
Hvis dette er opfyldt, kan modellen anvendes til at beskrive værdierne i dataserien. Hvis Pværdien<br />
> 0,05 kan modellen ikke anvendes, da dette ikke stemmer overens med de 5 %<br />
sandsynlighed for at forkaste en værdi, selvom den er sand ud fra den fundne model.<br />
En regressionsmodel kan også beskrives med determinationskoefficienten (R 2 ), denne<br />
redegør for, hvor stor en del af variationen i dataene regressionsmodellen redegør for.<br />
Determinationskoefficienten ligger mellem 0 og 1. Er R 2 = 1 redegør regressionsmodellen for<br />
100 % af dataene. R 2 kan dog ikke anvendes til at sammenligne to regressionsmodeller med<br />
forskellige antal frihedsgrader.<br />
Bilag 6 Side 2 af 3
K-PRO 7 Anvendt statistik Gruppe 2<br />
Variansanalyse<br />
For at undersøge om der signifikant forskel mellem to grupper af værdier, foretages en<br />
variansanalyse,seFigur2ogFigur3.<br />
Gruppe Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse<br />
------------------------------------------------<br />
1 3 Y1 Y1 N Y1 Ø<br />
2 3 Y2 Y2 N Y2 Ø<br />
3 3 Y3 Y2 N Y2 Ø<br />
-------------------------------------------------<br />
Figur 2: Grupper, deres middelværdi samt nedre og øvre grænse.<br />
Gruppe Antal Snit Homogene grupper<br />
------------------------------------------------<br />
1 3 Y1 X<br />
2 3 Y2 X<br />
3 3 Y3 X<br />
-------------------------------------------------<br />
Figur 3: Signifikant forskel.<br />
På Figur 2 angives først en gruppe af værdier, derefter antallet af værdier i denne gruppe<br />
(Antal), efterfulgt af en middelværdi (Snit). Til sidst angives en nedre og en øvre grænse for<br />
gruppen. Disse grænser er konfidensgrænser.<br />
På Figur 3 angives, om der er signifikant forskel mellem grupper af værdier. Hvis der<br />
eksempelvis ses på gruppe 1 og 2 i Figur 2, ses at den øvre grænse for gruppe 1 er ”Y1 Ø”og<br />
at den nedre grænse for gruppe 2 er ”Y2 N”. Om der er signifikant forskel mellem gruppe 1<br />
og 2 ses således:<br />
”Y1 N” < ”Y2 Ø” der er signifikantforskel mellem gruppe 1 og 2<br />
”Y1 N” > ”Y2 Ø” der er ikke signifikantforskel mellem gruppe 1 og 2<br />
I Figur 3 angives signifikant forskel ved, at X’erne under ”Homogene grupper” står forskudt<br />
for hinanden, som det er tilfældet mellem gruppe 1 og 2, og 1 og 3. Hvis X’erne står under<br />
hinanden, som det tilfældet mellem gruppe 2 og 3, er der ikke signifikant forskel.<br />
Bilag 6 Side 3 af 3
Bilag 7<br />
Måling af tilledt volumen
K-PRO 7 Måling af tilledt volumen Gruppe 2<br />
Måling af tilledt volumen<br />
Under fermenteringerne er der blevet tilledt substrat, saltsyre og ammoniakvand. Disse<br />
væsker er blevet tilledt fra bluecap flasker af forskellig størrelse. For at bestemme hvilket<br />
volumen der er blevet tilledt fra disse, er der på siden af flasken sat en lineal med millimeter<br />
mål, således at der på siden af flasken kunne aflæses, hvor mange mm væsken var faldet ved<br />
hver prøveudtagning. Dette antal mm skulle så omregnes til et volumen, hvilket er gjort på<br />
følgende måde:<br />
Eksempelvis er en 1 L flaske blevet fyldt med 5 · 200 mL vand, hvorefter der så er blevet<br />
aflæst, hvilken højde dette svarer til. Dette omregnes derefter til et volumen pr. millimeter.<br />
Måledata og beregning<br />
Flaskevolumen<br />
0,5 L<br />
Gennemsnit *<br />
1L<br />
Gennemsnit *<br />
2L<br />
Gennemsnit *<br />
Volumen<br />
[mL]<br />
Højde<br />
[mm]<br />
∆V<br />
[mL]<br />
∆H<br />
[mm]<br />
100 21 100 21<br />
200 41 100 20<br />
300 62 100 21<br />
400 82 100 20<br />
500 102 100 20<br />
100 20,3<br />
200 30 200 30<br />
400 59 200 29<br />
600 98 200 39<br />
800 114 200 16<br />
1000 144 200 30<br />
200 28,5<br />
250 22 250 22<br />
500 43 250 21<br />
750 63 250 20<br />
1000 83 250 20<br />
1250 102 250 19<br />
1500 122 250 20<br />
1750 141 250 19<br />
2000 164 250 23<br />
250 20,3<br />
Bilag 7 Side 1 af 2
K-PRO 7 Måling af tilledt volumen Gruppe 2<br />
10 L<br />
2000 50 2000 50<br />
3000 76 1000 26<br />
4000 103 1000 27<br />
5000 130 1000 27<br />
6000 156 1000 26<br />
7000 181 1000 25<br />
8000 207 1000 26<br />
9000 233 1000 26<br />
10000 259 1000 26<br />
Gennemsnit *<br />
1000 26,1<br />
*<br />
) Til beregningen af gennemsnittet er den første måling på hver flaske ikke medtaget.<br />
Herved er der taget højde for den volumenforskel, der kommer pga. at flasken har en krum<br />
bund.<br />
Nu udregnes volumen pr. millimeter<br />
Flaskevolumen ∆V<br />
∆H<br />
mL mm <br />
0,5 L 4,9<br />
1 L 7,0<br />
2 L 12,3<br />
10 L 38,3<br />
Bilag 7 Side 2 af 2
Bilag 8<br />
Prøveudtagning
K-PRO 7 Prøveudtagning Gruppe 2<br />
Prøveudtagning<br />
Det er blevet set på, om det kan retfærdiggøres at udtage prøver ned til hver 2. time. Dette er<br />
gjort ud fra udviklingen af cellemassekoncentration, for de anvendte værdier se Måledata 1 til<br />
6. Statistikken, der er anvendt til dette, er en variansanalyse, der er foretaget vha. programmet<br />
STATGRAPHICS Plus. Figurerne 1 til 6 er udarbejdet ved et konfidensinterval på 95 %.<br />
Fermentering 1<br />
Tid Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse<br />
-----------------------------------------------<br />
1 3 1,33 1,0340 1,6260<br />
2 3 1,41 1,1107 1,7026<br />
3 3 1,55 1,2507 1,8426<br />
4 3 1,92 1,6240 2,2160<br />
5 3 1,75 1,4574 2,0493<br />
6 3 1,69 1,3907 1,9826<br />
7 3 1,55 1,2540 1,8460<br />
8 3 1,83 1,5307 2,1226<br />
9 3 2,26 1,9674 2,5593<br />
10 3 2,56 2,2674 2,8593<br />
11 3 2,98 2,6874 3,2793<br />
12 3 3,13 2,8374 3,4293<br />
13 3 3,93 3,6340 4,2260<br />
15 3 7,16 6,8674 7,4593<br />
18 3 10,67 10,3707 10,9626<br />
21,5 3 17,59 17,2907 17,8826<br />
24,5 3 22,75 22,4574 23,0493<br />
26,5 3 24,62 24,3207 24,9126<br />
41,5 3 28,32 28,0240 28,6160<br />
-----------------------------------------------<br />
Fermentering 2<br />
Figur 1: Variansanalyse for prøveudtagningen under f1.<br />
Tid Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse<br />
-----------------------------------------------<br />
6 3 1,24 1,1160 1,3700<br />
8 3 3,00 2,8727 3,1273<br />
10 3 5,46 5,3293 5,5840<br />
12 3 7,00 6,8693 7,1240<br />
14 3 7,44 7,3127 7,5673<br />
16 3 7,85 7,7227 7,9773<br />
18 3 8,58 8,4560 8,7106<br />
20 3 9,95 9,8227 10,0773<br />
22 3 11,76 11,6360 11,8907<br />
24 3 13,98 13,8493 14,1040<br />
26 3 16,24 16,1093 16,3640<br />
28 3 18,33 18,2027 18,4573<br />
30 3 20,21 20,0793 20,3340<br />
32 3 21,71 21,5827 21,8373<br />
34 3 22,92 22,7960 23,0507<br />
-----------------------------------------------<br />
Figur 2: Variansanalyse for prøveudtagningen under f2.<br />
Tid Antal Snit Homogene grupper<br />
-----------------------------------------------<br />
1 3 1,33 X<br />
2 3 1,41 X<br />
3 3 1,55 X<br />
7 3 1,92 X<br />
6 3 1,75 XX<br />
5 3 1,69 XX<br />
8 3 1,55 XX<br />
4 3 1,83 XX<br />
9 3 2,26 XX<br />
10 3 2,56 XX<br />
11 3 2,98 X<br />
12 3 3,13 X<br />
13 3 3,93 X<br />
15 3 7,16 X<br />
18 3 10,67 X<br />
21,5 3 17,59 X<br />
24,5 3 22,75 X<br />
26,5 3 24,62 X<br />
41,5 3 28,32 X<br />
-----------------------------------------------<br />
Tid Antal Snit Homogene Grupper<br />
-----------------------------------------------<br />
6 3 1,24 X<br />
8 3 3,00 X<br />
10 3 5,46 X<br />
12 3 7,00 X<br />
14 3 7,44 X<br />
16 3 7,85 X<br />
18 3 8,58 X<br />
20 3 9,95 X<br />
22 3 11,76 X<br />
24 3 13,98 X<br />
26 3 16,26 X<br />
28 3 18,33 X<br />
30 3 20,21 X<br />
32 3 21,71 X<br />
34 3 22,92 X<br />
-----------------------------------------------<br />
Bilag 8 Side 1 af 3
K-PRO 7 Prøveudtagning Gruppe 2<br />
Fermentering 3<br />
Tid Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse<br />
-----------------------------------------------<br />
6 3 0,84 0,7564 0,9236<br />
10 3 0,80 0,7131 0,8803<br />
14 3 1,18 1,0964 1,2636<br />
18 3 1,48 1,3931 1,5603<br />
22 3 2,45 2,3697 2,5370<br />
26 3 4,12 4,0331 4,2003<br />
30 3 7,27 7,1831 7,3503<br />
34 3 12,53 12,4464 12,6136<br />
-----------------------------------------------<br />
Fermentering 4<br />
Figur 3: Variansanalyse for prøveudtagningen under f3.<br />
Tid Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse<br />
-----------------------------------------------<br />
7,5 3 0,42 0,3388 0,5079<br />
9,5 3 0,37 0,2855 0,4545<br />
12,5 3 0,70 0,6155 0,7845<br />
14,5 3 1,04 0,9555 1,1245<br />
18 3 2,09 2,0088 2,1779<br />
20 3 3,34 3,2555 3,4245<br />
24 3 7,16 7,0788 7,2479<br />
26 3 10,14 10,0555 10,2245<br />
32,25 3 25,68 25,5955 25,7645<br />
34 3 28,04 27,9588 28,1279<br />
-----------------------------------------------<br />
Fermentering 5<br />
Figur 4: Variansanalyse for prøveudtagningen under f4.<br />
Tid Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse<br />
-----------------------------------------------<br />
9 3 1,38 1,1836 1,5697<br />
11 3 2,20 2,0069 2,3931<br />
13 3 3,59 3,3969 3,7831<br />
15 3 4,44 4,2436 4,6297<br />
17 3 6,04 5,8503 6,2364<br />
19 3 8,82 8,6269 9,0131<br />
21 3 12,65 12,4536 12,8397<br />
23 3 17,11 16,9169 17,3031<br />
26 3 22,15 21,9536 22,3397<br />
29 3 31,82 31,6303 32,0164<br />
32 3 40,49 40,2969 40,6831<br />
34 3 44,66 44,4669 44,8531<br />
-----------------------------------------------<br />
Figur 5: Variansanalyse for prøveudtagningen under f5.<br />
Tid Antal Snit Homogene grupper<br />
-----------------------------------------------<br />
6 3 0,84 X<br />
10 3 0,80 X<br />
14 3 1,18 X<br />
18 3 1,48 X<br />
22 3 2,45 X<br />
26 3 4,12 X<br />
30 3 7,27 X<br />
34 3 12,53 X<br />
-----------------------------------------------<br />
Tid Antal Snit Homogene grupper<br />
-----------------------------------------------<br />
7,5 3 0,42 X<br />
9,5 3 0,37 X<br />
12,5 3 0,70 X<br />
14,5 3 1,04 X<br />
18 3 2,09 X<br />
20 3 3,34 X<br />
24 3 7,16 X<br />
26 3 10,14 X<br />
32,25 3 25,68 X<br />
34 3 28,04 X<br />
-----------------------------------------------<br />
Tid Antal Snit Homogene grupper<br />
-----------------------------------------------<br />
9 3 1,38 X<br />
11 3 2,20 X<br />
13 3 3,59 X<br />
15 3 4,44 X<br />
17 3 6,04 X<br />
19 3 8,82 X<br />
21 3 12,65 X<br />
23 3 17,11 X<br />
26 3 22,15 X<br />
29 3 31,82 X<br />
32 3 40,49 X<br />
34 3 44,66 X<br />
-----------------------------------------------<br />
Bilag 8 Side 2 af 3
K-PRO 7 Prøveudtagning Gruppe 2<br />
Fermentering 6<br />
Tid Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse<br />
-----------------------------------------------<br />
10 3 0,62 0,5396 0,7071<br />
13 3 0,65 0,5696 0,7371<br />
15 3 0,62 0,5362 0,7038<br />
17 3 0,60 0,5129 0,6804<br />
19 3 0,66 0,5762 0,7438<br />
21 3 0,88 0,7996 0,9671<br />
23 3 0,92 0,8329 1,0004<br />
-----------------------------------------------<br />
Figur 6: Variansanalyse for prøveudtagningen under f6.<br />
Tid Antal Snit Homogene grupper<br />
-----------------------------------------------<br />
10 3 0,62 X<br />
13 3 0,65 X<br />
15 3 0,62 X<br />
17 3 0,60 X<br />
19 3 0,66 X<br />
21 3 0,88 X<br />
23 3 0,92 X<br />
-----------------------------------------------<br />
Det ses af Figur 1, at der fra fermenteringens start udtages prøver med en times interval. Der<br />
er ikke fundet signifikant forskel mellem disse prøver, hvorfor det besluttes fremover at<br />
udtage den første efter ca. 10 timers fermentering. Herefter udtages der kun prøver i<br />
intervaller ned til hver 2. time.<br />
Af Figur 2 ses tydeligt en forskel på tørstofindholdet i prøver udtaget ved forskellige tider.<br />
Derfor kan det retfærdiggøres, at der udtages prøver ned til hver 2. time.<br />
Det ses af Figur 3 og 4, at de to første prøveudtagninger ikke er signifikant forskellige,<br />
herefter ses den samme tydelige forskel som ved f2. Grunden til at der ikke er signifikant<br />
forskel mellem de to første prøveudtagninger ved f3 og f4 er, at gæren ikke er påbegyndt den<br />
eksponentielle vækst.<br />
Ved f5 er den første prøve udtaget efter 9 timer, se Figur 5, grundet at der ikke var<br />
signifikant forskel på tidligere prøveudtagninger ved f3 og f4. Derudover ses det af Figur 5, at<br />
der herefter tydeligvis er en forskel på tørstofindholdet i prøver udtaget ved forskellige tider.<br />
Det ses tydeligt af Figur 6, at der ikke er signifikant udvikling i tørstofindholdet før efter<br />
21 timer, hvilket indikerer en forlænget nølefase.<br />
Bilag 8 Side 3 af 3