2. Immunhistokemisk teknik - NordiQC

2. Immunhistokemisk teknik 

Af Ole Nielsen 

2.1 INDLEDNING ........................................................................................................... 11 

2.2 DEFINITIONER.......................................................................................................... 11 

2.2.1 Antigener ....................................................................................................... 11 

2.2.2 Antistoffer ...................................................................................................... 11 

2.3 PRÆPARATION: PARAFFINSNIT........................................................................................ 13 

2.3.1 Fiksering .......................................................................................................143 

2.3.2 Afkalkning ...................................................................................................... 14 

2.3.3 Vævsfremføring til paraffin ............................................................................... 15 

2.3.4 Skæring, montering, tørring og opbevaring af snit................................................ 15 

2.3.5 Afparaffinering og hydrering.............................................................................. 15 

2.4 PRÆPARATION: CYTOLOGISK MATERIALE OG FRYSESNIT............................................................ 16 

2.4.1 Fremstilling .................................................................................................... 16 

2.4.2 Tørring og opbevaring ...................................................................................... 16 

2.4.3 Fiksering ........................................................................................................ 17 

2.5 BLOKERING AF “ENDOGEN AKTIVITET” ............................................................................... 18 

2.5.1. Endogen enzymaktivitet ................................................................................... 18 

2.5.2 Endogen biotin ................................................................................................ 19 

2.6 EPITOP DEMASKERING (RETRIEVAL).................................................................................. 20 

2.6.1 Proteolytiske enzymer ...................................................................................... 20 

2.6.2 Varmeinduceret epitop demaskering (HIER) ........................................................ 21 

2.7 BLOKERING AF USPECIFIK ANTISTOFADHÆSION ..................................................................... 27 

2.8 PRIMÆRT ANTISTOF.................................................................................................... 28 

2.8.1 Valg af antistof................................................................................................ 28 

2.8.2 Afprøvning af antistoffer ................................................................................... 29 

2.8.3 Antistof-inkubation .......................................................................................... 30 

2.8.4 Antistoftiter, inkubationstid og temperatur .......................................................... 31 

2.8.5 Fortyndervæske .............................................................................................. 32 

2.8.6 Opbevaring og holdbarhed af antistoffer ............................................................. 32 

2.8.7 Kontrolprocedurer............................................................................................ 33 

2.9 SKYLLEPROCEDURE .................................................................................................... 33 

2.9.1 Skyllebuffer .................................................................................................... 34 

2.9.2 Skylletid......................................................................................................... 34 

2.10 DETEKTIONSSYSTEMER ............................................................................................. 34 

2.10.1 Direkte teknikker............................................................................................. 34 

2.10.2 Indirekte teknikker .......................................................................................... 35 

2.11 KROMOGEN/SUBSTRATOPLØSNING ................................................................................ 41 

2.11.1 Horse radish peroxidase ................................................................................... 41 

2.11.2 Alkalisk phosphatase........................................................................................ 42 

2.12 KERNEFARVNING .................................................................................................... 44 

2.13 REFERENCER......................................................................................................... 44 

Mogens Vyberg 2005

10 Immunhistokemisk teknik 

Figur 2.1: Flowchart over metodologiske parametre i den immunhistokemiske teknik. 

Nedfrysning 

Skæring af snit 

Montering af snit 

Tørring af snit 

Opbevaring 

Fiksering 

Anvendte forkortelser 

Ab(s) antibody(-ies) (antistof(fer)) 

AP alkaline phophatase 

CD cluster of differentiation 

CK cytokeratin 

ER estrogen receptor 

Materiale 

Væv Celler 

Fiksering 

Evt afkalkning 

Fremføring til 

paraffin 

Skæring af snit 

Montering af snit 

Tørring af snit 

Afparaffinering og 

hydrering 

Blokering af 

“endogen aktivitet” 

Epitop demaskering 

Blokering af 

“uspecifik adhæsion” 

Primært antistof 

Skylleprocedure 

Detektionssystem 

Kromogen/substratopl. 

Kernefarvning 

Montering af dækglas 

Cytospin, dup, 

smear m.v. 

Tørring 

Opbevaring 

Fiksering 

HRP horse radish (peberrod) peroxidase 

mAb monoclonal antibody 

pAb polyclonal antibody 

PBS phosphate buffered saline 

PgR progesteron receptor 

rmAb rabbit (kanin) mAb 

TBS tris buffered saline 

Mogens Vyberg 2005

Anvendt immunhistokemi 11 

2.1 Indledning 

Immunhistokemiske teknikker er traditionelt 

“multi-step” teknikker, hvor mange forskellige 

metodologiske parametre har betydning 

for det endelige resultat. I dette kapitel, der 

tager sit udgangspunkt i den praktiske immunhistokemi, 

som den udøves i diagnostisk 

sammenhæng, belyses de vigtigste parametres 

indflydelse på farvningsresultaterne. Der 

fokuseres specielt på immunenzymatiske 

teknikker på paraffinsnit, frysesnit og cytologisk 

materiale. 

Gennemgangen af parametrene og deres 

betydning for farvningsresultatet følger “flowchartet”, 

Fig. 2.1. Foruden den teoretiske 

gennemgang af de enkelte parametre anføres 

en række basale, praktiske præparations- og 

farvningsmæssige protokoller. Disse protokoller 

beskriver gennemprøvede, robuste og 

reproducerbare metoder. 

Teknikker, der anvendes til immunfluorescens, 

immunelektronmikroskopi og molekylærbiologiske 

undersøgelser, omtales ikke. 

2.2 Definitioner 

2.2.1 Antigener 

Et antigen er et molekyle, der kan give anledning 

til dannelse af antistof ved injektion i 

et hvirveldyr. Langt de fleste antigener er 

proteiner eller proteinforbindelser, men kulhydrater 

og lipider kan også virke som antigener. 

Nogle kemiske substanser, fx metaller, 

er ikke i sig selv antigener, men kan i forbindelse 

med et protein danne en struktur, der 

udløser antistofdannelse. Sådanne substanser 

kaldes haptener. De antigene egenskaber 

ligger som regel i ét eller flere mindre områder 

af et molekyle. Disse områder kaldes 

antigene determinanter eller epitoper og består 

oftest af 4-8 aminosyrer eller monosaccharidenheder. 

En epitop kan bestå af en 

kontinuert sekvens af nabostillede aminosyrer 

i den primære proteinstruktur, eller af flere 

mindre aminosyresekvenser, der er bragt i 

tæt relation til hinanden gennem proteinmolekylets 

foldning (tertiære struktur). (Fig. 

2.2). 

Figur 2.2: Model af antigen. De sorte områder repræsenterer 

antigene epitoper. 

Mogens Vyberg 2005 

2.2.2 Antistoffer 

Antistoffer eller immunglobuliner (Ig) er glycoproteiner, 

der produceres i en organisme 

som reaktion på en antigenstimulation. Antistofferne 

binder sig med stor affinitet og specificitet 

til det stimulerende antigen. Antistoffer 

produceres i plasmaceller, der er transformerede 

B-lymfocytter, og afgives bl.a. til 

blodet, hvorfra de kan isoleres. I højere hvirveldyr 

findes fem klasser af immunglobuliner: 

IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. Alle immunglobuliner 

er opbygget af tunge og lette proteinkæder. 

De fem immunglobulinklasser er bl.a. 

karakteriseret ved hver deres indhold af tunge 

kæder, α (alfa: IgA), δ (delta: IgD), ε 

(epsilon: IgE), γ (gamma: IgG) og µ (my: 

IgM). De lette kæder, der er fælles for alle 

immunglobulinklasser, kan enten være af 

type κ (kappa) eller λ (lambda). 

De fleste antistoffer, der anvendes til immunhistokemi, 

er af IgG-klassen, mens et mindre 

antal er af IgM-klassen. IgG-molekylet består 

af to tunge kæder (γ) og to lette kæder (κ 

eller λ) bundet sammen med disulfidbroer i 

en Y-formet struktur (Fig. 2.3). 

På grundlag af antigene forskelle i de såkaldt 

konstante områder af de tunge kæder kan 

IgG-molekylerne yderligere inddeles i 4 subklasser: 

IgG1, IgG2a, IgG2b og IgG3. Med 

enzymerne papain og pepsin kan 

IgG-molekylet spaltes i flere komponenter. 

Papain spalter IgG i to antigen-bindende 

fragmenter benævnt fragment antibody (Fab) 

og ét fragment benævnt fragment crystalline 

eller fragment complement (Fc). 

Proteolytisk behandling med pepsin giver et 

F(ab’)2 fragment. Fc-fragmentet indeholder 

bl.a. bindingssteder for Protein A, complement 

og receptorer på makrofager og granulocytter. 

Den specifikke antigenbindende 

egenskab ligger i den terminale, såkaldt variable 

region af Fab. 

Figur 2.3: Model af IgG molekyle. IgG er opbygget af 

2 tunge og 2 lette kæder forbundet ved hjælp af disulfidbindinger. 

Papain spalter IgG i 2 antigenbindende 

fragmenter betegnet Fab og 1 fragment crystalline 

benævnt Fc. Pepsin proteolyse giver et F(ab´)2 fragment. 

Pepsin 

Papain 

Fc 

Fab 

F(ab’) 2


Den variable region indeholder den specielle 

aminosyresekvens og rummelige opbygning, 

der er komplementær til den epitop på antigenet, 

som det pågældende antistofmolekyle 

er rejst imod. Rummeligt passer epitop til 

antistof som “en nøgle til en lås”. Bindingen 

mellem antistof og epitop er en non-covalent 

binding, der oftest er en blanding af elektrostatiske 

kræfter, hydrogenbindinger, van der 

Waalske kræfter og hydrofob interaktion. 

Reaktionen mellem antigen og antistof er 

reversibel og kan beskrives som: 

Ag + Ab ‹―› AgAb kompleks 

Ligevægtskonstanten K er herefter defineret 

som: 

[AbAg] −1 

K = M 

[Ab]x[Ag] 

hvor [Ab] er den molære koncentration af frie 

antistofmolekyler, [Ag] er den molære koncentration 

af frit antigen, og [AbAg] den molære 

koncentration af antistof-antigen komplekser. 

Antistoffers bindingsstyrke til antigen 

betegnes affinitet. For antistoffer med høj 

affinitet er ligevægtskonstanten i størrelsesorden 

10 10 til 10 12 . For antistoffer med lav 

affinitet ligger ligevægtskonstanten nede 

omkring 10 5 . I immunhistokemisk sammenhæng 

giver antistoffer med høj affinitet naturligvis 

de bedste resultater, bl.a. fordi de i 

højere grad er i stand til at forblive bundet til 

antigen gennem hele proceduren. 

Polyklonale antistoffer 

Polyklonale antistoffer (pAbs) er blandinger af 

antistoffer fra forskellige kloner. De produceres 

ved at immunisere et dyr (kanin, svin, 

ged eller lignende) med et oprenset antigen. 

Dyret vil rejse et immunrespons, og de producerede 

antistoffer kan høstes gennem gentagende 

tapninger af blod og efterfølgende 

isolering af serum. I dyret vil der oftest opformeres 

mange kloner af plasmaceller (polyklonalt 

respons), der hver for sig producerer 

antistofmolekyler rettet mod én af epitoperne 

i antigenet (Fig. 2.4). 

Der vil således til en hver af antigenets epitoper 

kunne produceres mange forskellige antistoffer, 

der varierer mere eller mindre med 

hensyn til affinitet og specificitet. 

Blandt disse mange forskellige antistoffer kan 

forekomme nogle, der krydsreagerer med 

epitoper på andre molekyler, end det antigen, 

Figur 2.4: Polyklonalt antistof (A) og monoklonalt 

antistof (B) rettet mod det samme antigen 

de er rejst imod. Sådanne krydsreagerende 

antistoffer bør fjernes fra antisera ved hjælp 

af absorption med det krydsreagerende molekyle. 

Kun de færreste kommercielle antistoffer 

findes tilgængelige i fuldserumformat. 

Risikoen for at det store indhold af 

serumproteiner vil give problemer med baggrundsfarvning 

er for stor. I stedet sælges de 

som en oprenset immunglobulinfraktion. Immunglobulinfraktionen 

vil foruden de specifikke 

antistoffer også indeholde dyrets “normale” 

cirkulerende immunglobuliner. Yderligere 

oprensning af antistof kan foretages 

ved hjælp af affinitetskromatografi, hvor man 

på en antigenkoblet kromatografisøjle kan 

isolere de specifikke antistoffer. 

Da pAbs består af mange forskellige antistofmolekyler 

rettet mod mange forskellige 

epitoper på det samme antigen, kan affinitetsbegrebet 

ikke direkte anvendes. For disse 

beskrives bindingsstyrken ved udtrykket aviditet. 

Aviditeten er populært sagt en slags 

“affinitetsmiddelværdi” for de forskellige antistoffer, 

der indgår i det polyklonale antiserum. 

Monoklonale antistoffer 

Monoklonale antistoffer (mAbs) er antistoffer, 

der alle stammer fra samme celleklon. I modsætning 

til et pAb vil mAb udelukkende bestå 

af fuldkommen ens antistofmolekyler rettet 

mod én og samme epitop på antigenet (Fig. 

2.4). 

mAbs produceres ved hjælp af Köhler og Milstein’s 

hybridomteknik (1). Teknikken, der 

går ud på at fusionere immuniserede 

B-lymfocytter med myelomceller, er beskrevet 

i detaljer af Gatter et al. (2). Produktionen 

af mAbs sker i sin oprindelige form ved, 

at en mus immuniseres med antigen, der ikke 

nødvendigvis er fuldstændig rent, hvorefter 

lymfocytterne isoleres fra milten på den immuniserede 

mus. Disse lymfocytter, der naturligt 

har en begrænset levetid, fusioneres 

derefter med myelomceller, der er maligne og 

i principet udødelige celler, og som er blevet 

valgt, fordi de har mistet evnen til at producere 

og secernere immunglobuliner. 

Ved fusionen mellem de to celletyper opstår 

der en cellehybrid, der kan secernere immunglobuliner, 

hvis specificitet er bestemt af musens 

lymfocytter, og som har myelomcellernes 

egenskaber med hensyn til neoplastisk 

proliferation. Hybridomcellerne klones og 

undersøges for antistofproduktion. De antistofproducerende 

kloner undersøges herefter 

med henblik på at finde dem, der producerer 

antistof rettet mod det immuniserende antigen. 

De pågældende antistoffer undersøges 

dernæst i flere testsystemer, her iblandt immunhistokemi, 

for at fastslå forhold omkring 

affinitet, specificitet og eventuel krydsreaktivitet 

for antistoffet. Når interessante kloner 

er identificeret, kan yderligere opformering 

foretages. Opformeringen foregår ofte i store 

Mogens Vyberg 2005


cellekulturer, hvor antistoffet høstes som 

supernatant fra store dyrkningsflasker. En 

alternativ måde til opformering er den såkaldte 

“ascites produktion”, hvor hybridomceller 

sprøjtes ind i peritonealhulen på mus, 

hvor der udvikles en antistofproducerende 

tumor. Antistoffet høstes ved at tappe ascitesvæske 

af musen. Navngivning af mAbs 

foregår normalt ved at angive antigenets 

navn efterfulgt af en tal- eller bogstavkode, 

der refererer til den antistofproducerende 

celleklon (fx anti-ERα, klon 1D5). 

Kommercielt tilgængelige kanin mAbs 

(rmAbs) så først for alvor dagens lys i 2003, 

hvor NeoMarker i samarbejde med Epitomics 

lancerede en stribe rmAbs, der fungerer glimrende 

på paraffinsnit. Blandt de bedste i den 

serie kan nævnes anti- cyclin-D1, klon SP4; 

anti-ERα, klon SP1; anti-PgR, klon SP2; anti- 

Ki67, klon SP6; og anti-COX2, klon SP21. 

Andre SP-antistoffer fungerer dog mindre 

godt, og et enkelt er trukket tilbage fra markedet. 

Produktionen af rmAbs foregår efter 

samme princip som for muse mAbs. Når der 

tidligere ikke fandtes kommercielt tilgængelige 

rmAbs, skyldes det bl.a. problemer med at 

finde en passende fusionspartner (myelomcelle) 

til kaninlymfocytter, d.v.s. en fusionspartner, 

der kunne skabe en stabil hybridomcellekultur 

med høj antistofproduktion. Dette 

problem og andre produktionstekniske problemer 

er nu løst. Da rmAbs byder på fordele 

som fx højere affinitet end muse mAbs, vil 

fremtiden helt sikkert bringe mange nye 

rmAbs på markedet. 

2.3 Præparation: paraffinsnit 

Paraffinsnit fremstilles sædvanligvis ud fra 

histologisk materiale. Der er dog tiltagende 

interesse for, med henblik på immunhistokemiske 

undersøgelser, også at fremstille paraffinsnit 

ud fra cytologisk materiale (se afsnit 

2.4.1). 

2.3.1 Fiksering 

En essentiel del af al histologisk og cytologisk 

teknik er fikseringen. Ved fiksering forstås 

normalt en kemisk behandling, der har til 

formål at immobilisere og stabilisere vævets 

og cellernes bestanddele. I immunhistokemisk 

sammenhæng skal et fiksativ ideelt 

kunne: 

1. Immobilisere antigener. 

2. Bevare antigenisitet. 

3. Bevare vævs- og cellestruktur. 

4. Bevare permeabiliteten for immunreagenser 

(antistoffer mv.). 

Naturligvis findes det ideelle immunhistokemiske 

fiksativ ikke. Specielt kravet om bevarelse 

af antigenisitet vil ofte komme i konflikt 

med kravene om bevarelse af struktur og 

immobilisering af antigener. Med antigenisitet 

forstås sædvanligvis tilstedeværelsen af antistofbindende 

aktivitet. Da bindingen mellem 

antistof og epitop er stærkt afhængig af epi- 


topens rumlige struktur, vil antigenisiteten 

næsten altid være under indflydelse af den 

kemiske påvirkning, som et hvert fiksativ vil 

udøve på antigener. Fiksativer kan inddeles i 

2 hovedgrupper: 

1. Koagulerende fiksativer 

(“non-cross-linking” fiksativer). 

2. Gelerende fiksativer (“cross-linking” fiksativer). 

Koagulerende fiksativer 

Til de koagulerende fiksativer hører bl.a. etanol, 

metanol, picrinsyre og acetone. Ved den 

koagulerende fiksering åbnes proteinernes 

tertiære struktur og hydrofobe grupper samt 

reaktive grupper blotlægges. Disse blotlagte 

grupper vil herefter kunne reagere med 

grupper i andre proteinmolekyler under etablering 

af større uordnede aggregater (Fig. 

2.5). På trods af den vidtgående strukturelle 

modifikation af antigenerne er antigenisiteten 

forbavsende velbevaret for ganske mange 

antigeners vedkommende. En af årsagerne til 

dette er, at såvel den primære som den sekundære 

struktur af antigenerne ikke påvirkes. 

Koagulerende fiksativer er således meget 

velegnet til fiksering af fx intermediære 

filamenter som CK og vimentin. Den morfologiske 

bevarelse af væv fikseret i rene koagulerende 

fiksativer er dog ikke den bedste. 

Samtidig er der en risiko for, at antigener 

med en lav molekylvægt vil ekstraheres under 

fikseringen. Dette er de væsentligste 

årsager til, at koagulerende fiksativer sjældent 

bruges rutinemæssigt til fiksering med 

henblik på paraffinindlejring. I den forbindelse 

er det vigtigt at bemærke, at etanol dehydrering 

vil virke som en “koagulerende efterfiksering” 

på væv, der kun er fikseret kort tid 

i formaldehyd. Immunhistokemiske metoder 

optimeret til formalinfikseret væv kan ikke 

uden videre anvendes til undersøgelser på 

væv fikseret i koagulerende fiksativ. Antigener, 

der ikke er fikseret tilstrækkeligt i formalin, 

vil blive helt eller delvis fikseret i alkohol 

under vævspræparering med risiko for at 

blive ekstraheret (fx S-100 protein). 

Figur 2.5: Gelerende og koagulerende fiksativer. Efter 

Lyon (3). 

Koagulerende 

fiksering 

Polypeptidkæde 

Hydrofobe aminosyreradikaler 

Nativt protein 

Gelerende fiksering 

Hydrofile aminosyreradikaler 

Tværbindinger


Gelerende fiksativer 

Gelerende fiksativer virker bl.a. ved at etablere 

tværbindinger mellem visse aminosyreradikaler 

i proteinerne (antigenerne) (Fig. 

2.5). Foruden at give en glimrende bevarelse 

af vævsmorfologien er tværbindingerne med 

til at stabilisere antigenerne i en nativ eller 

kun svagt modificeret konformation, således 

at de ikke koagulerer under den efterfølgende 

dehydrering. På trods af en stabilisering i 

stort set nativ konformation, påvirkes antigenisiteten 

for mange antigener negativt af 

gelerende fiksering. Blandt de gelerende fiksativer 

er 4% neutral buffet formaldehyd 

(NBF) klart det foretrukne fiksativ i diagnostisk 

rutinesammenhæng. Formaldehyd menes 

at påvirke antigenisiteten på flere måder: 

1. Maskering af epitoper. 

a. gennem konformative ændringer i antigenet. 

b. gennem immobilisation af nabomakromolekyler 

(sterisk hindring). 

c. gennem compleksbinding af metalioner, 

især Ca-ioner 

2. Kemisk modifikation af reaktive aminosyrer 

i epitopen. 

3. Ekstraktion af antigener under fikseringen 

eller den efterfølgende præparation. 

Da fiksering påvirker antigenisiteten, bør 

fikseringstiden så vidt mulig standardiseres. 

Fikseringstider på 24 - 48 timer i NBF giver 

generelt de bedste resultater. Ved for kort 

fikseringstid er der som nævnt ovenfor risiko 

for, at en del af epitoperne i virkeligheden 

bliver alkoholfikserede, hvilket markant kan 

ændre betingelserne for immunhistokemisk 

påvisning. 

Marzo et al. (87) viste i et studie på prostatektomier, 

at antallet af p27KIP1 positive 

epitelceller i prostata falder, hvis fikseringstiden 

i NBF nedsættes. Fikseringstider under 1 

døgn gav væsentlig svagere reaktioner end 

fikseringstider på 2 døgn eller mere. Antip27 

KIP1 , klon 57 fungerer bedst på væv fikseret 

mellem 2 og 7 døgn i NBF (87). 

Ved for lang fikseringstid ses en tiltagende 

maskering af mange epitoper. Da formaldehydbindingen 

er delvis reversibel, er det muligt 

at rette op på en del af problemerne vedrørende 

bevarelse af antigenisitet. Langvarigt 

skyl (dage!) i vand efter fiksering af rehydrerede 

paraffinsnit kan løse en del af problemerne 

vedrørende maskering og kemisk modifikation 

af epitoper, men vil sjældent være 

relevant på grund af muligheden for epitopdemaskering 

(afsn. 2.6). 

2.3.2 Afkalkning 

Væv, der indeholder større mængder calciumsalte, 

fx knoglemateriale, kræver normalt 

en afkalkning, for at brugbare paraffinsnit 

kan produceres. I praksis benyttes mange 

forskellige afkalkningsmedier, som hver for 

sig kan påvirke antigenisiteten i vævet. 

Afkalkningsmedier kan inddeles i 4 hovedgrupper: 

1. Stærke, uorganiske syrer, fx HCl og HNO3 2. Kommercielle blandinger indeholdende 

bl.a. stærke syrer, fx Decal, New Decal, 

RBD, S/P, RDO mv. 

3. Svage, organiske syrer, fx myresyre og 

eddikesyre 

4. Kompleksbindere, fx EDTA. 

De stærke syrer og de kommercielle blandingsprodukter 

udmærker sig ved at afkalke 

vævet hurtigt. De kan dog ikke ubetinget 

anbefales til materiale, der efterfølgende skal 

anvendes til immunhistokemi. Bruges således 

Decal (Histolab, Västra Frölunda) til afkalkning 

(4-6h) på NBF fikseret væv, tabes antigenisitet 

helt eller delvist for de fleste antigener 

(4). Andre kommercielle blandingsprodukter 

har vist sig mere anvendelige. Arber 

et al. (57) fandt med RBD (Rapid Bone Decal, 

USA) og S/P Decal (USA) som afkalkningsmedier 

tilfredsstillende resultater med 52 ud 

af 57 antistoffer. 

Desværre sås med vigtige antistoffer (som 

anti-epithelial antigen, Ber-EP4; anti-p53, 

klon DO7; anti-ERα, klon 1D5; anti-PgR, klon 

ICA; anti-elastase, klon NP57; og anti-Ki67, 

klon MIB1) i visse tilfælde svage eller negative 

reaktioner sammenlignet med ikke-afkalkede 

kontrolpræparater. I samme 

undersøgelse farvede alle 57 antistoffer svarende 

til eller kraftigere end kontolpræparaterne, 

hvis EDTA-baseret afkalkning blev 

anvendt. Dette understreger EDTA’s egenskab 

som skånsomt afkalkningsmedium. 

Ulempen er blot, at afkalkning i EDTA er meget 

langsom. Det kan selv for mindre biopsier 

være nødvendigt at afkalke i op til flere dage. 

Et godt alternativ til både de stærke syrer og 

EDTA er derfor de svage organiske syrer. 

Specielt gode resultater er opnået med myresyre 

(10% myresyre eller Kristensens opløsning, 

der er 4 M med hensyn til myresyre og 

0,5 M med hensyn til Na-formiat), der afkalker 

en hel del hurtigere end EDTA. Knoglebiopsier 

kan således afkalkes på 3-6 timer i 

Kristensens opløsning. Herefter kan der produceres 

paraffinsnit af høj kvalitet, med mulighed 

for at påvise de fleste antigener, der 

normalt overlever NBF-fiksering og paraffinindlejring. 

En forudsætning for de gode resultater 

er selvfølgelig, at vævet er fikseret ordentligt 

inden afkalkningen påbegyndes. Med 

hensyn til bevarelse af antigenisitet afkalker 

Kristensens opløsning generelt ligeså skånsomt 

som EDTA - også hvad angår nucleære 

antigener som p53, Ki67, ERα og PgR (4). 

Der ses dog undtagelser. Anti-CD79a, klon 

JCB117 giver således efter afkalkning i myresyre 

en noget svagere reaktion, end hvad der 

opnås efter EDTA afkalkning, mens antielastase, 

klon NP57 slet ikke tåler syreafkalkning 

(hverken stærke syrer eller myresyre). 

Klon NP57 kan således kun anvendes, hvis 

afkalkningen foretages i EDTA (4). 

Mogens Vyberg 2005


2.3.3 Vævsfremføring til paraffin 

Forholdsvis få studier har beskæftiget sig 

med betydningen af forskellige dehydrerings-, 

klarings- og paraffinindlejringsmedier i 

forbindelse med immunhistokemiske farvninger. 

Meget tyder imidlertid på, at “vævsfremføringen” 

i et vist omfang bidrager til maskeringen 

af antigene epitoper i paraffinsnit. 

Antigener som Ki67 og terminal deoxynucleotidyl 

transferase (TdT), der lader sig påvise 

umiddelbart i både kryosnit og cytologisk 

materiale selv efter 6-24 timers fiksering i 

NBF, lader sig ikke uden forudgående demaskering 

påvise i paraffinsnit af væv fikseret 

den samme tid i NBF. Vævsfremføringens 

bidrag til epitopmaskering er på den anden 

side konstant og ret uafhængig af, hvilke 

dehydrerings- og klaringsmedier (og for den 

sags skyld paraffintyper), der anvendes 

(4,5,56). Det, der synes vigtigst for bevarelsen 

af antigenisiteten, er, at vævet dehydreres 

fuldstændigt og at paraffininfiltreringen er 

komplet. Forkortelse af tiden til dehydrering 

og paraffinindfiltrering har således for visse 

antistoffer (fx anti-CD20, klon L26) betydet 

nedsat reaktivitet. 

2.3.4 Skæring, montering, tørring og 

opbevaring af snit 

Paraffinsnit bør skæres 3-5 µm tykke, strækkes 

fuldkommen på varmt vandbad (ca. 

45°C) og monteres på glas coatede med fx 

poly-L-lysin eller silane, eller på elektrostatisk 

behandlede glas som fx SuperFrost®Plus. 

Anvendelse af forbehandlede objektglas nedsætter 

drastisk risikoen for at miste snit undervejs 

i farvningsproceduren. Efter montering 

skal snittene tørres, hvorved bindingen 

til glasset forstærkes. De fleste epitoper tåler 

tørring ved 60°C i 1 time. En mere skånsom 

tørring opnås ved 37°C natten over (56), 

eventuelt efterfulgt af 60°C i 1 time. Enkelte 

antigener (epitoper) er meget varmefølsomme, 

det gælder fx proliferating cell nuclear 

antigen (PCNA) Ønsker man således at påvise 

PCNA i paraffinsnit med fx antistoffet klon 

PC10, opnås klart de bedste resultater ved at 

tørre snittene natten over ved stuetemperatur. 

Velfikseret og velpræpareret materiale indstøbt 

i paraffin synes at bevare antigenisiteten 

af formalinresistente epitoper godt. Der 

er dog undtagelser. Dash et al. (58) har vist, 

at androgenreceptor immunreaktiviteten aftager 

med tiden i paraffinblokke. Med anvendelse 

af mAb F39.4.1 på 9 prostatakarcinomer 

registredes ved hjælp af billedanalyse 

et tab af immunreaktivitet i paraffinblokkene 

svarende til ca. 40% over en 

periode på 22 mdr. På trods af disse fund er 

den generelle holdning stadig, at antigenisiteten 

bevares godt i paraffinblokke, hvad talrige 

retrospektive studier baseret på materialer 

op til 30-40 år gamle også viser. 


Til gengæld er antigenisiteten i skårne og 

glasmonterede paraffinsnit ikke nær så holdbar 

som i intakte paraffinblokke. Mange nyere 

studier (6,7,59,60,61,62,79,80,81) har vist, 

at flere antigener taber antigenisitet som 

funktion af snittenes alder og opbevaringstemperatur. 

Der har i de forskellige studier 

været nogen forskel på, hvilke antigener man 

har fundet følsomme. Følgende diagnostisk 

vigtige antistoffer har alle i et eller flere studier 

vist et varierende tab af reaktivitet i 

gamle snit sammenlignet med nye snit af de 

samme blokke: Anti-ERα, klon 1D5 og 6F11; 

anti-anaplastic lymphoma kinase, klon ALK-1; 

anti-cyclin D1, klon P2D11F11; anti-terminal 

deoxynucleotidyl transferase, pAb; anti-p53, 

klon DO7 og PAb1801; anti-bcl2, klon 124; 

anti-chromogranin A, klon LK2H10; anti-factor 

VIII, pAb; anti-CD3, pAb; anti-cerbB-2, 

klon 3B5; anti-E-cadherin, klon 

HECD-1; anti-vimentin, klon V9; anti- 

CD45R0, klon UCHL-1; anti-epidermal growth 

factor receptor, klon EGFR.113; anti-retinoblastom 

gen protein, klon G3-245; anti- 

ACTH, pAb og anti-Ki67, klon MIB1. 

Årsagen til fænomenet er ukendt, men da 

tabet af reaktivitet for nogle antigener (fx 

p53 og ERα) ses allerede efter få ugers opbevaring 

(59,60,61), er det et problem, der 

specielt i store retrospektive studier må tages 

højde for. Flere studier har vist (62,79,81), at 

tabet af antigenisitet er størst, hvis snittene 

opbevares ved stuetemperatur eller højere. 

Opbevaret ved 4ºC er tabet væsentlig mindre, 

og ved -80ºC ses der intet tab efter 3 

års opbevaring (62). Med vekslende held er 

tabet af antigenisitet forsøgt restaureret gennem 

forstærket epitop retrieval (forlænget 

kogetid i HIER-buffer eller brug af alternative 

buffere, se afsn. 2.6.2) eller opvejet ved at 

bruge primære antistoffer i højere koncentrationer. 

Som en konsekvens af ovenstående må det 

anbefales, at paraffinsnit, der skal opbevares 

mere end 14 dage, før de skal anvendes (fx 

positive kontrolsnit og snit til videnskabelige 

studier), som minimum bliver opbevaret ved 

4ºC eller endnu bedre ved -20ºC eller -80ºC, 

og at man ved hjælp af sammenligning med 

friskskårne snit registrerer omfanget af et 

evt. tab i antigenisitet. 

2.3.5 Afparaffinering og hydrering 

Som for enhver anden farvemetode er en 

komplet fjernelse af paraffin og dernæst afparaffineringsmediet 

(xylen, Estisol eller lignende) 

og rehydreringsmediet (etanol) vitale 

elementer i den immunhistokemiske teknik. 

De fleste laboratoriers standard afparaffinerings- 

og rehydreringsprocedure vil oftest 

direkte kunne overføres til immunfarvningerne.


2.4 Præparation: cytologisk 

materiale og frysesnit 

2.4.1 Fremstilling 

Cytologiske præparater 

En vigtig forudsætning for succes med immuncytokemiske 

teknikker er optimal præparering 

af materialet. For cytologiske materialer 

(smears, cytospin-, monolayer- og duppræparater) 

er det vigtigt, at der anvendes 

coatede eller elektrostatisk behandlede objektglas, 

at cellerne så vidt muligt findes 

jævnt fordelt på objektglasset, og at cellerne 

er så velbevarede og intakte som muligt. 

Disse krav er ikke forskellige fra de præparationsmæssige 

krav, der stilles til almindelige 

cytologiske farvemetoder som May-Grünwald/Giemsa 

og Papanicoulaus. Dog er det 

med immuncytokemiske teknikker endnu 

vigtigere at anvende præparater, hvor cellerne 

ligger i ét lag og ikke for tæt. I celletætte 

cytologiske materialer vil der ofte opstå problemer 

med “trapping” og uspecifik adhæsion 

af antistofferne med baggrundsfarvning til 

følge. 

Mange problemer med cytologiske præparater 

kan løses ved at fremstille celleblokke i 

form af formalinfikserede, paraffinindstøbte 

centrifugater eller sedimentater, der kan 

håndteres som almindeligt histologisk materiale 

(jfr. afsnit 2.3). 

Protokol for fremstilling af celleblokke 

1. Den ufikserede celleholdige væske centrifugeres 

10 min. ved 3000 omdr./min, og supernatanten 

hældes fra. 

2. Bundfaldet tilsættes humant plasma (3 dråber 

til ca. ½ ml bundfald). Plasma og bundfald 

blandes ved hjælp af pipetten. 

3. Der tilsættes bovint trombin* (2 dråber til 3 

dråber plasma). Hvis ikke opløsningen koagulerer 

inden for ét minut, tilsættes yderligere én 

dråbe trombin (gentages efter behov). Herefter 

tilsættes neutral buffet formalin, og materialet 

føres efter en fikseringstid på 24 h frem til paraffin. 

*Bovine Thrombin (Biofac A/S), 1 ampul à 10.000 

units opløses i 100 ml 0,9% NaCl. Væsken fordeles 

i kryorør og nedfryses ved -20º C. 

Frysesnit 

Frysesnit skæres normalt 4-6 µm tykke og 

monteres på coatede eller eletrostatisk behandlede 

glas. Som ved alle undersøgelser på 

frysesnit er det vigtigt, at vævet nedfryses 

hurtigt, så fryseartefakter undgås. Nedfrysning 

i isopentan ved -79ºC giver gode resultater 

(3). Det er ligeledes vigtigt, at skæring 

foregår ved den temperatur, der er optimal 

for den pågældende vævstype (oftest mellem 

-12ºC og -18ºC). Efter skæring på cryostat 

optøs vævsblokken som regel for at gennemgå 

normal fikserings- og præparationsprocedure 

mhp fremstilling af paraffinsnit til supplerende 

histokemiske evt. immunhistokemiske 

analyser. 

Ønskes paraffinsnit af tidligere nedfrosset 

materiale anvendt til immunhistokemi, bør 

fortolkning af farvningsresultaterne foretages 

med forsigtighed. Reaktiviteten af en del 

antigener har vist sig at være svækket i paraffinsnit 

af tidligere nedfrosset væv, i forhold 

til hvad den er i paraffinsnit af ikke tidligere 

frosset materiale fra samme patienter. Egerton 

et al. (82) fandt flere eksempler på betydelig 

svækkelse af reaktiviteten på tidligere 

nedfrosset materiale når antistoffer mod S- 

100, synaptophysin, neuron specific enolase, 

carcinoembryonic antigen, chromogranin og 

melanosoma specific antigen (HMB45) anvendtes. 

Lignende fund er gjort i eget laboratorium 

I en række lymfomer er cyclin D1 

reaktiviteten set svækket, mens spørgsmålet 

om klonalitet i B-lymfomer gennem påvisning 

af kappa og lambda kæder i flere tilfælde ikke 

kunne besvares, når vævet tidligere havde 

været nedfrosset. 

CryoJane teknik 

Med introduktionen af ”sentinel node (SN) 

proceduren” indenfor operation af mammakancer 

og malignt melanom er antallet af 

frysesnit på lymfeknuder steget betydeligt på 

mange patologiske instituter. Lymfeknuder er 

i sig selv ikke vanskellige at producere gode 

frysesnit af. Er det lymfatiske væv infiltreret 

med store mængde fedtceller, som kan være 

tilfældet med SN, er historien dog en ganske 

anden. Lymfatisk væv og fedtvæv har meget 

forskellige skæreegenskaber, hvilket vanskeliggør 

tilfredsstillende snitkvalitet. Til at afhjælpe 

disse problemer har en såkaldt ”tape 

transfer” teknik ved navn ”CryoJane” vist sig 

brugbar. Ved hjælp af en speciel tape, der 

understøtter vævet under skæring, overføres 

snit til specielle objektglas. Disse er coatede 

med en UV-sensitiv lim. Efter UV belysning 

kan tapen fjernes, efterladende et intakt frysesnit 

af høj teknisk kvalitet. CryoJane snit 

kan anvendes til HE farvning, div. histokemiske 

teknikker og immunhistokemi (evt 

Haste-EnVision, se afsnit 2.10.2). CryoJane 

systemet markedsføres af firmaet Instrumedics 

(www.instrumedics.com). 

2.4.2 Tørring og opbevaring 

Efter fremstilling af cytologiske præparater og 

frysesnit er det i de fleste tilfælde hensigtsmæssigt 

at tørre vævet/cellerne på objektglasset. 

Tørring inden evt. fiksering (se afsn. 

2.4.3) er med til at bevare morfologien uden 

nævneværdigt tab af antigenisitet. Tørretiden 

vil typisk være mellem 1 time og natten over. 

Tørringen kan evt. foregå under ventilator 

eller lignende. Efter endt tørring er materialet 

klar til evt. fiksering og efterfølgende immuncytokemi. 

Skal materialet ikke immunfarves 

umiddelbart efter tørring, bør opbevaringsformen 

overvejes. Opbevaret ukritisk ved 

stuetemperatur vil de fleste antigener blive 

Mogens Vyberg 2005


tiltagende vanskelige at påvise (sammenlign 

afsn. 2.3.4). For mange antigeners vedkommende 

ses der efter 3 dages opbevaring ved 

stuetemperatur ingen eller kun marginal 

svækkelse af antigenisiteten. For andre antigeners 

vedkommende er der allerede efter 3 

dages opbevaring set en betydelig svækkelse 

af reaktionen. Det drejer sig bl.a. om myosin 

af slow og fast type påvist med flere forskellige 

kommercielle mAbs (4). Den sikreste 

måde at opbevare sine cytologiske materialer 

og frysesnit - med henblik på senere immuncytokemi 

- er derfor at pakke de tørrede 

præparater i stanniol og nedfryse dem. Ved 

-18°C vil antigenisiteten bevares i måneder. 

Ved -80°C og derunder bevares antigenisiteten 

sædvanligvis i årevis. Når de tørrede og 

frosne præparater tages ud af fryseren til 

immunfarvning, er det vigtigt, at de ikke 

pakkes ud af stanniolen, før de har opnået 

stuetemperatur. Udpakning af kolde præparater 

vil medføre kondensdannelse på materialet, 

hvilket kan forringe den cytologiske kvalitet. 

2.4.3 Fiksering 

I modsætning til paraffinsnit har man med 

cytologiske materialer og frysesnit alle muligheder 

for at optimere fikseringsproceduren 

med henblik på optimal bevarelse af netop de 

antigener (epitoper) materialet skal undersøges 

for. Når der bortses fra epitoper, der 

dårligt tåler fiksering (se nedenfor) er der en 

lang række forskellige fiksativer til rådighed i 

forskellige immunhistokemiske sammenhænge. 

Ofte vil det være nødvendigt med en 

efterfølgende epitopdemaskering (se afsn. 

2.6). Blandt de vigtigste fiksativer er: 

1. Acetone, 100% 

2. Acetone/metanol (forhold 1:1) 

3. Acetone/metanol/formaldehyd (forhold 

19:19:2) 

4. Neutral buffet formaldehyd (NBF). 4% 

5. Neutral buffet formaldehyd (NBF). 4%, 

efterfulgt af detergentbehandling 

6. Neutral buffet formaldehyd (NBF) 4%, 

efterfulgt af epitopdemaskering (se afsn. 

2.6) 

7. Zambonis fiksativ. 

Acetone 

Acetone er et “rent” koagulerende fiksativ. 

Fiksering af frysesnit i 10 min. (cytologisk 

materiale behøver kun fiksering i 90 sek.) 

ved stuetemperatur eller ved 4°C bevarer 

antigenisiteten udmærket for de fleste antigener. 

Acetonefiksering er derfor af mange 

det foretrukne til frysesnit og cytologisk materiale, 

når det fx drejer sig om påvisning af 

overfladeantigener. En ulempe er, at morfologien 

ikke altid er optimalt bevaret. 


Der er desuden en række antistoffer, hvortil 

acetone ikke kan anvendes som fiksativ. 

Blandt disse er følgende diagnostisk vigtige 

antistoffer: anti-ERα (mange forskellige kloner); 

anti-PgR (mange forskellige kloner); 

anti-p53 (mange forskellige kloner); anti-terminal 

deoxynucleotidyl transferase 

(TdT)(såvel mAbs som pAbs); anti-Ki67, klon 

MIB1; anti-PCNA, klon PC10; og anti-C-erbB2, 

pAb. For nogle af disse antistoffers 

vedkommende er problemet øjensynligt, 

at antigenet helt eller delvist ekstraheres i 

acetone eller de efterfølgende procedurer. 

Acetone/metanol 

Acetone/metanol (1:1) er en blanding af koagulerende 

fiksativer. Fiksering 30-90 sek 

giver en rimelig skånsom fiksering, som kan 

anbefales til hæmatologisk materiale i kombination 

med en forstærket (repeteret, se nedenfor) 

alkalisk phosphatase anti-alkalisk 

phosphatase (APAAP)-teknik. Acetone/metanol 

giver i sammenligning med ren 

acetonefiksering en langt bedre cytologisk 

bevarelse af cellerne. En væsentlig ulempe 

ved acetone/metanol fiksering er, at reaktiviteten 

for en del epitopers vedkommende 

svækkes i forhold til fiksering alene med acetone. 

Svækkelsen af reaktionen kan delvis 

kompenseres ved hjælp af et meget følsomt 

detektionssystem, fx APAAP med forstærkning. 

Der er epitoper, der ikke lader sig påvise 

efter acetone/metanol fiksering. Indenfor 

hæmatologien kan bl.a. følgende mAbs således 

ikke anvendes på acetone/metanol-fik 

seret materiale: anti-CD10, klon SS2/36; 

anti-CD16, klon VIFcRIII; anti-CD13, klon 

My7; anti-CD33, klon VM54; anti-CD103, Ber 

ACT8; anti-hairy cell leukemia, klon DBA.44; 

og anti-glycophorin A, klon D2-10-2. 

Acetone/metanol/formaldehyd 

Acetone/metanol/formaldehyd (19:19:2) 

giver en kombineret koagulerende og gelerende 

fiksering. Fiksering i 30-90 sek. giver 

yderligere forbedringer af den cytologiske 

bevarelse i forhold til acetone/metanol fiksering. 

Ulempen er, at der samtidig ses en 

yderligere svækkelse af immunreaktiviteten 

for en del epitopers vedkommende. 

Neutral buffet formalin (NBF) 

NBF (4%) giver en ren gelerende fiksering. 

Fiksering i 2-30 min. giver noget nær optimal 

morfologisk bevarelse på frysesnit, samtidig 

med at NBF er et fremragende fiksativ til 

specielt mange kernelokaliserede og intracytoplasmatiske 

antigener. På frysesnit opnås 

gode resultater med NBF, også for antigener, 

der ikke umiddelbart kan påvises på paraffinsnit. 

Dette fænomen er en understregning af, 

at ikke kun NBF-fikseringen bidrager til problemer 

med tab af antigenisitet i paraffinsnit.


Dehydrerings-, klarings-, og paraffininfiltreringsproceduren 

må ligeledes forventes 

at bidrage i et vist omfang til maskeringen 

af epitoper. 

Blandt de mange antigener, hvortil der med 

fordel anvendes NBF-fiksering, kan nævnes: 

S-100 protein, p53 oncoprotein, C-erbB2 

oncoprotein, TdT, ERα og PgR og Ki67 antigen. 

Anvendes NBF til fiksering af cytologisk materiale, 

vil det i de fleste tilfælde være nødvendigt 

at foretage en form for permeabilisering 

af cellemembraner inden den immunhistokemiske 

farvning. Permeabilisering kan udføres 

på flere måder. Det letteste er at efterbehandle 

de NBF-fikserede celler med et detergent 

(sæbelignende stof) 

Protokol for kombineret NBF fiksering og 

permeabilisering 

1. Fiksering i 4% NBF 15 min. 

2. Skyl i buffer 2 min. 

3. Triton-X-100 (0,05%-0,5% i TBS) 10 min. 

4.Skyl i buffer og fortsæt med immunfarvning. 

Detergentbehandlingen ekstraherer dele af 

lipidmaterialet i cellens membraner, hvilket 

gør det lettere for immunreagenserne at penetrere 

dem. Effekten af detergentbehandling 

på cytologisk materiale vil tydeligt kunne 

iagttages ved påvisning af fx p53 oncoprotein 

og andre kernerelaterede antigener som TdT, 

Ki67 og lignende. Specielt for p53’s vedkommende 

giver NBF-fiksering efterfulgt af Triton-X-100 

behandling en voldsom forstærkning 

af reaktionen sammenlignet med den 

“rene” NBF-fiksering. 

NBF og varmeinduceret epitopdemaskering 

(HIER) 

Mange antistoffer giver på cytologisk materiale 

fremragende resultater, hvis fiksering i 4% 

NBF kombineres med HIER (se afsn. 2.6.2 

inkl. afsn. vedr. HIER protokoller). 

Zambonis fiksativ 

Zambonis Fiksativ er et blandingsfiksativ 

bestående af: 2 g paraformaldehyd i 85 ml 

0,15 M fosfatbuffer pH 7,3 tilsat 15 ml vandig 

mættet picrinsyre. Fiksativet giver en kombineret 

gelerende og koagulerende fiksering. 

Det er bl. a. anbefalet ved undersøgelser for 

Retinoblastom (RB) gen protein. Flere forskellige 

anti-RB mAbs (klon G3-245, R128 og 

RB1), giver efter Zamboni-fiksering de bedste 

resultater. Tilsvarende er fiksativet anbefalet 

ved brug af anti-ERα (klon LH1 og LH2) og 

anti-PgR (klon 1A6). 

Ingen fiksering 

Især inden for muskelpatologien findes en 

række antigener, der bedst påvises uden 

nogen form for fiksering. Det drejer sig primært 

om proteiner med en relativ høj molekylvægt 

og/eller med en vis strukturel forankring 

i muskelcellens cytoplasma eller cellemembran. 

Påvisningen af slow myosin, klon 

WBMHCS; fast myosin, klon My32; dystrophin, 

klon Dy86C5; og en række 

dystrophinrelaterede antigener foregår derfor 

i praksis ved at applicere det primære antistof 

på de tørre frysesnit uden nogen forudgående 

behandling (fiksering eller lignende). 

Det skal dog tilføjes, at de fleste af disse 

antigener ikke desto mindre kan påvises i 

formalinfikserede muskelbiopsier med udmærkede 

resultater. 

2.5 Blokering af “endogen 

aktivitet” 

2.5.1. Endogen enzymaktivitet 

De vigtigste immunenzymatiske detektionssystemer 

benytter sig af peroxidase, alkalisk 

phosphatase, glukose oxidase eller betagalactosidase 

som enzymlabel (markør) 

Blandt disse enzymer er peroxidase og alkalisk 

phosphatase klart de foretrukne. I lighed 

med beta-galactosidase forekommer begge 

enzymer naturligt (endogent) i en række 

celler i humant væv. Det kan derfor være 

nødvendigt at blokere eller hæmme den endogene 

enzymaktivitet. 

Peroxidase (PO) 

PO-aktivitet forekommer med varierede styrke 

i granulocytter, monocytter og makrofager. 

Desuden indeholder erytrocytter såkaldt 

pseudoperoxidaseaktivitet, der giver de 

samme fortolkningsmæssige problemer. I 

paraffinsnit af NBF fikseret materiale er 

egentlig peroxidaseaktivitet stort set elimineret, 

mens pseudoperoxidaseaktiviteten i 

erytrocytter “overlever”. 

En lang række forskellige kemiske forbehandlinger 

vil være i stand til at blokere den endogene 

peroxidaseaktivitet: 

Protokoller til blokering af endogen peroxidase 

aktivitet 

1. 0,5% brintperoxid i metanol 

eller 

10 min. 

2. 1% - 3% brintperoxid i TBS 

eller 

10 min. 

3. 0,5% - 3% brintperoxid i etanol 

eller 

10 min. 

4. 0,3% brintperoxid og 0,1% Na-azid i TBS 10 min. 

Mogens Vyberg 2005


Alle 4 protokoller kan anbefales til blokering 

af endogen peroxidaseaktivitet på 

NBF-fikserede paraffinsnit. Protokol 1 og 3 

skal altid appliceres før evt. demaskering, 

mens protokol 2 og 4 kan appliceres enten 

før demaskering eller efter primært antistof 

(men før HRP-link!). Ingen af de 4 protokoller 

bør anvendes lige efter demaskering, da 

mange epitoper er følsomme overfor både 

metanol/etanol og brintperoxid. Til gengæld 

tyder meget på, at langt de fleste NBFfikserede 

epitoper, der ”overlever” fiksering, 

vævspræparation og paraffinindlejring, også 

klarer en forbehandling med henblik på blokering 

af endogen peroxidaseaktivitet, hvis 

denne foretages før evt. demaskering. Desværre 

er der undtagelser. Anti-CD4, klon 1F6 

reagerer med en epitop, der er meget følsom 

overfor brintperoxid, også selvom blokeringen 

foregår før demaskering. På paraffinsnit, hvor 

dette antistof skal anvendes, bør blokering 

derfor udelades eller foretages efter det primære 

antistof. 

På cytologiske materialer og frysesnit er epitoper 

generelt mere følsomme overfor kemiske 

påvirkninger, end de er i paraffinsnit af 

NBF fikserede væv. En del laboratorier undlader 

derfor at blokere for endogent peroxidaseaktivitet 

i disse materialer. I de fleste tilfælde 

lader det sig gøre uden problemer, da 

det bl.a. med hjælp fra et negativt kontrolsnit 

er muligt at identificere den endogene peroxidaseaktivitet. 

I hæmatologisk materiale og 

cytologisk materiale med kraftig blodtilblanding, 

hvor der kan forudses fortolkningsproblemer 

på grund af endogen peroxidaseaktivitet, 

kan protokol 4 anbefales. Li et al. (8) 

fandt, at der med denne protokol kunne opnås 

en effektiv blokering af endogen peroxidaseaktivitet 

uden tab af antigenisitet eller 

morfologiske detaljer. Undersøgelsen blev 

udført med 23 forskellige diagnostisk vigtige 

antistoffer inden for hæmatologien. Tilsvarende 

gode eller bedre resultater er opnået 

ved først at applicere protokol 4 efter det 

biotinylerede sekundære antistof i en labelled 

streptavidin biotin (LSAB) eller ABC teknik 

(9). 

For epitoper der tåler NBF fiksering kan der 

være en elegant alternativ løsning på problemet 

med endogen peroxidaseaktivitet. På 

cryostatsnit og mange cytologisk materialer 

vil en kombination af NBF fiksering og en 

varmebehandling ved over 95°C i HIER-buffer 

blokere effektivt for endogen peroxidaseaktivitet 

(se afsn. 2.6.2 ”NBF-HIER protokoller” 

og 2.10.2 ”Protokol Haste-EnVision+”). I 

kombination med NBF fiksering ses således 2 

positive effekter af varmebehandling: Dels en 

forstærkning af immunreaktionen gennem 

demaskering (se afsn. 2.6.2) og dels en blokering 

af endogen enzymaktivitet. 

En simpel løsning på problemer med endogen 

peroxidaseaktivitet er selvfølgelig at anvende 

et detektionssystem, der er baseret på alkalisk 

phosphatase som enzym-label (fx APAAP, 

se afsnit 2.10.2). 


Alkalisk phosphatase 

Alkalisk phosphatase (AP) aktivitet forekommer 

akkurat som PO naturligt i en række 

celler i humant væv. AP kan klassificeres i 

mindst 5 grupper, alt efter hvilket væv de 

stammer fra (10). Den AP, der anvendes til 

enzymkonjugater, udvindes fra kalvetyndtarm. 

AP i tarm er resistent overfor enzymhæmmeren 

levamisol, mens AP i lever og 

knoglemarv er følsom for levamisol. Tilsætning 

af 1 mM levamisol til kromogen/substratopløsningen 

vil derfor effektivt blokere 

endogen AP aktivitet relateret til disse celler 

og væv, mens enzymlabel ikke påvirkes. Dette 

gør AP-baserede detektionsystemer (fx 

APAAP) meget anvendelige til hæmatologiske 

materialer. Undersøgelser (11) har dog vist, 

at tilsætning af 1 mM levamisol i visse detektionssystemer. 

(LSAB-AP) kan have en vis 

hæmmende effekt på enzymlabel. Afhængig 

af graden af endogen AP anbefales det således 

at bruge lavere koncentrationer af levamisol 

(0,25 mM - 0,5 mM), der ikke har vist 

hæmmende effekt på AP-label. Alternativt 

kan snittene opvarmes til 65ºC, hvorved APaktiviteten 

elimineres. 

AP-baserede detektionssystemer har deres 

begrænsninger specielt på materiale fra mave-tarmkanalen 

og placenta, da levamisol 

ikke hæmmer den endogene AP i disse væv. 

Der kan også i visse tilfælde ses levamisolresistent 

AP i tumorer. I et cytologisk studie af 

25 non-hæmopoietiske tumorer fandes levamisolresistent 

AP i 4 tilfælde (10), der ikke 

udgik fra ventrikel/tarm eller placenta. 

2.5.2 Endogen biotin 

Avidin-biotin og steptavidin-biotin detektionssystemer 

(ABC, LSAB mv., se afsn. 2.10) 

benytter sig af den naturlige affinitet, avidin 

og steptavidin har for biotin (vitamin H). Biotin 

forekommer i store mængder sammen 

med enzymet pyruvat carboxylase i mitochondrier. 

Det betyder, at der i mitochondrie-rige 

celler er risiko for falsk positiv 

reaktion svarende til streptavidins eller avidins 

reaktion med endogen biotin. Artefaktet 

ses specielt i metabolisk aktive celler som fx 

lever, nyre, binyre, spytkirtler mv. En del 

karcinomer, heriblandt mamma- og colonkarcinomer 

vil potentielt også kunne give anledning 

til denne falske positive reaktion. Sædvanligvis 

forekommer endogen biotin intracytoplasmatisk, 

men kan også ses intranucleært. 

I graviditetsrelateret endometrium 

er der således i 32 af 69 prøver set biotinholdige 

intranucleære inklusioner (12), der selvfølgelige 

ikke må forveksles med virus inklusioner 

(fx herpes simplex). Problemet med 

endogen biotin er naturligvis kun relateret til 

de biotinbaserede detektionssystemer og har 

tidligere kun været et reelt problem på cytologisk 

materiale og kryostatsnit. I paraffinsnit 

maskeres det meste biotin nemlig effektivt og 

gav således sjældent problemer med falsk


Figur 2.6: Blokering af endogen biotin. 

positiv reaktion i ikke-demaskerede snit. Med 

introduktionen af varmeinduceret epitopdemaskering 

(se afsn. 2.6) er problemet vokset, 

og specielt efter den tiltagende brug af 

mere effektive kogemedier som EDTA/EGTA 

og Tris-HCl ved højt pH er problemet blevet 

påtrængende. Giver endogen biotin fortolkningsmæssige 

problemer, bør der enten vælges 

alternativt detektionssystem (fx APAAP 

eller et af de mange polymersystemer - se 

afsn. 2.10.2) eller en forbehandling med blokering 

af endogen biotin for øje (Fig. 2.6). 

Protokol til blokering af endogen biotin 

1. Avidin 0,1% 10 min. 

2. PBS eller TBS 2 min. 

3. Biotin 0,01% 10 min. 

4. PBS eller TBS 2 min. 

Blokeringen iværksættes umiddelbart før 

blokering af uspecifik antistofadhæsion, hvilket 

for paraffinsnit selvfølgelig betyder, at 

biotinblokeringen udføres efter evt. epitop 

demaskering. 

Protokollen (evt. udført med kit) giver i de 

fleste tilfælde en tilfredsstillende blokering af 

biotin i paraffinsnit og frysesnit. Udover den 

ekstra håndtering af glassene er også prisen 

en væsentlig ulempe ved denne protokol. 

Anvendes kommercielle kits, er prisen generelt 

høj: blokering ved hjælp af DakoCytomations 

kit koster således 4,69 kr. pr. glas og 

Vectors kit koster 3,31 kr. Zymeds kit koster 

“kun” 2,16 kr. pr. glas, men er ikke helt så 

effektivt til at blokere endogent biotin som de 

to øvrige (4). 

Det er ikke væsentlig billigere at købe de 

rene varer selv, da rent avidin er forbavsende 

kostbart. Miller et al. (63) har beskrevet et 

simpelt og brugbart alternativ til de dyre kits. 

I stedet for at bruge ren avidin kan man an- 

vende fortyndede æggehvider, der indeholder 

store mængder avidin. Prisen bringes hermed 

ned på 10 øre pr. glas. Da de fortyndede 

æggehvider og biotinopløsningen (0,2% i 

PBS) tilmed er holdbare og kan genbruges 

(æggehvider 1 uge, biotin 1 måned), kan 

hele proceduren foregå i farveskåle uden 

krævende håndtering af de enkelte glas. 

Millers protokol til blokering af endogen biotin 

1. Skyl i dest vand 5 min. 

2. Fortyndede æggehvider (2 æggehvider, 

fyld op til 200 ml med dest vand) 15 min. 

3. Grundigt skyl i flere hold dest vand 5 min. 

4. Biotin (Merck No. 500030) 0,2% i PBS, 

pH 7,2 med 15mM natriumazid 15 min. 

5. PBS eller TBS 2 min. 

Ved kontakt med buffersalte er der risiko for, 

at æggehvide-protein vil udfælde i snittene, 

hvorfor der skal skylles grundigt i destilleret 

vand. 

2.6 Epitop demaskering 

(retrieval) 

I paraffinsnit af NBF-fikseret materiale vil 

mange antigene epitoper ikke eller kun dårligt 

kunne påvises. Det har vist sig, at en stor 

del af disse epitoper ikke er ødelagte, men 

blot er maskerede. Mange maskerede epitoper 

kan demaskeres og dermed gøres “immunreaktive” 

igen. De to vigtigste, principielt 

forskellige teknikker, der i dag bruges til demaskering 

af antigene epitoper er: 

1. Forbehandling med proteolytiske enzymer. 

2. Varmeinduceret epitop demaskering (HIER 

= heat-induced epitop retrieval). 

Hertil kommer andre metoder, der er nødvendige 

til specielle antigener, fx behandling 

med 100% myresyre til amyloider, samt diverse 

kombinationer af proteolyse og HIER 

(se tabel 2.2) 

Ultralyd har ligeledes været anvendt til epitop 

retrieval. For enkelte antigener synes ultralyd 

at have en vis demaskerende effekt, men dog 

væsentlig mindre effekt end HIER (86). Som 

generel demaskeringsteknik synes ultralyd 

derfor uinteressant. 

2.6.1 Proteolytiske enzymer 

Anvendelsen af proteolytiske enzymer til demaskering 

af antigene epitoper blev introduceret 

i 70’erne (13,14) og har siden vundet 

stor udbredelse. Teknikken gjorde det muligt 

at påvise et stort antal antigener, der tidligere 

var vanskelige eller umulige at påvise i 

paraffinsnit af NBF fikseret materiale. Mange 

forskellige enzymer kan anvendes. Trypsin, 

pepsin eller pronase E er de mest populære. 

Mogens Vyberg 2005


Protokoller til proteolytisk forbehandling 

a. Trypsin protokol: 

Trypsin 250, Difco 0152-13 0,050 g 

Tris-buffer 0,05M, pH 7,8 med 

0,1% CaCl2 37° 50 ml 

Afhængig af fikseringstiden i NBF forbehandles 

5-20 min. ved 37°C. Inden inkubation i enzymopløsning 

forvarmes snittene 5 min. i destilleret vand 

ved 37°C. 

b. Pepsin protokol: 

Pepsin, Sigma No. P7012 0,160 g 

HCl, 0,01 M 37°C 40 ml 



forvarmes snittene 5 min. i destilleret 

vand ved 37° C. 

c. Pronase E (Protease type 14) protokol: 

Protease type XIV,Sigma No. P5147 0,025 g 

TBS 0,05M, pH 7,4 37°C 50 ml 



forvarmes snittene 5 min. i destilleret 

vand ved 37°C. 

d. Proteinase K protokol*: 

Proteinase K, DakoCytomation S3004 40 µl 

Tris-buffer 0,05M, pH 7,5 stuetemp. 50 ml 


5-15 min. ved stuetemperatur. Denne protokol kan 

med fordel appliceres immunostainere som Tech- 

Mate og Autostainer. 

*Proteinase K opløsningen kan købes klar til brug. 

Biokemisk er enzymernes reaktivitet og specificitet 

velkendt. Trypsin katalyserer således 

spaltningen af peptidbindinger i hvilke aminosyrerne 

arginin og lysin forekommer. Chymotrypsin, 

som findes i de fleste kommercielle 

trypsinprodukter, hydrolyserer navnligt 

peptidbindinger, hvor de aromatiske aminosyrers 

carboxylsyrer indgår. Pepsin angriber 

en del forskellige peptidbindinger, men peptidbindinger, 

hvor de aromatiske aminosyrers 

aminogrupper indgår, spaltes hurtigst. Pronase 

E, der udvindes fra Streptomyces griseus, 

er som de fleste andre bakterielle proteaser 

meget lidt specifik med hensyn til hvilke peptidbindinger, 

der angribes. Pronase E er således 

i stand til at katalysere spaltningen af 

størstedelen af de typer peptidbindinger, der 

forekommer i humant væv. Tilsvarende gælder 

proteinase K. 

Er enzymernes biokemiske reaktivitet og 

specificitet velkendt, så er baggrunden for 

deres demaskerende effekt i immunhistokemisk 

sammenhæng til gengæld noget uklar. 

Den positive effekt på muligheden for at påvise 

maskerede epitoper beror givet vis på 

flere faktorer. Blandt de vigtigste er: 

1. Evnen til spaltning af peptidbindinger i 

umiddelbar nærhed af de NBF-inducerede 


tværbindinger (methenbroer). Dette er 

med til at åbne op for en del af de “skjulte” 

epitoper. En direkte spaltning af 

methenbroerne synes mindre sandsynligt. 

2. Fraspaltning af blokerende nabomolekyler. 

3. Permeabiliteten af vævet øges gennem 

spaltningen af proteinerne. 

Selvom trypsin, pepsin og pronase biokemisk 

er forskellige med hensyn til hvilke peptidbindinger 

de spalter i proteinerne, vil der i mange 

tilfælde kun ses mindre forskelle i deres 

evne til at demaskere en given epitop. I de 

fleste tilfælde er pronasen dog mest effektiv, 

hvilket forklarer dette enzyms popularitet. 

Pepsin har vist sig særlig velegnet til demaskering 

af epitoper i extracellulære strukturproteiner 

som collagen III, collagen IV, fibronectin, 

laminin og P-component. De gode 

resultater opnås specielt, hvis inkubationen i 

pepsin forlænges til 1-2 timer. Pronase E er 

især velegnet anti-LMW-CK, klon CAM 5.2, og 

anti-CD21, klon 1F8. 

Udover den positive effekt er der også væsentlige 

ulemper forbundet med forbehandlingen 

med proteolytiske enzymer. For 

det første er der en hel del epitoper, der ikke 

tåler enzymforbehandling, hvilket naturligvis 

udelukker teknikken som universel demaskeringsteknik. 

For det andet er der alvorlige 

problemer med standardisering af metoden. 

Problemerne stammer væsentligst fra det 

faktum, at inkubationstiden for den proteolytiske 

forbehandling er stærkt afhængig af 

fikseringstiden i NBF. Alle undersøgelser viser, 

at jo længere tids fiksering der er anvendt 

i NBF, jo længere tids proteolytisk forbehandling 

skal iværksættes for at opnå den 

ønskede epitop-demaskering. Omvendt skal 

enzymforbehandlingstiden nedsættes for 

væv, der kun er fikseret i kort tid i NBF. For 

lang tids enzymforbehandling i forhold til fikseringstiden 

vil give en gradvis “fordøjelse” af 

vævssnittet med tab af morfologiske detaljer 

til følge. For at optimere den enzymatiske 

forbehandling er det med andre ord nødvendigt 

at kende fikseringstiden på det væv, 

man ønsker at behandle. Standardisering af 

den proteolytiske forbehandling kompliceres 

yderligere ved, at den optimale proteolysetid 

også kan variere fra celletype til celletype. 

For keratinpåvisning i forskellige epiteltyper 

er således beskrevet en betydelig tidsvariation 

for optimal proteolysetid (15). Endelig 

skal det nævnes, at falsk positiv reaktion kan 

ses ved anvendelse af anti-CK20, klon 

Ks20.8, hvis der anvendes proteolytisk forbehandling, 

specielt hvis vævet kun er kortvarigt 

fikseret (


skering (Heat-Induced Epitop Retrieval - 

HIER). Teknikken har på dramatisk vis forbedret 

mulighederne for immunhistokemi på 

paraffinsnit. HIER åbner mulighed for at anvende 

antistoffer på paraffinsnit, som tidligere 

med konventionel teknik (proteolyse mv.) 

kun gav svagt positiv reaktion eller slet ingen 

(20-23,76). Blandt de vigtigste antistoffer i 

denne gruppe, der omfatter mere end 40, 

kan nævnes: anti-Ki67, klon MIB1; anti-ERα, 

klon 1D5; anti-PgR, klon ICA og 1A6; anti-bcl-2, 

klon 124; anti-CD5, klon 4C7; anti-CD8, 

klon C8/144B; anti-CD 23, klon 1B12; 

anti-CD44, klon DF1485; anti-CD44v6, klon 

2F10; anti-CD79a, klon JCB117; anti-RB, klon 

G3-245; anti-CD4, klon 1F6; anti-E-Cadherin, 

klon HECD-1; anti-TdT, pAb; anti-dystrophin, 

klon Dy4; og anti-Cyclin D1, klon DSC-6, 

P2D11F11 og SP4 samt pAb fra Biocare. 

Der findes en endnu større gruppe antistoffer, 

omfattende 50-80% af de på patologiafdelinger 

anvendte, som før introduktionen af HIER 

gav åbenlyst svagere reaktioner på paraffinsnit 

end frysesnit. Efter HIER kan der nu for 

denne store gruppe antistoffer opnås resultater 

på paraffinsnit, der med hensyn til farvningsintensitet 

og detektionsgrænser modsvarer, 

hvad der optimalt kan opnås på frysesnit. 

Til denne gruppe hører mange antistoffer 

mod bl.a. CK’er og CD-markører (fx anti-CD3, 

anti-CD20, antiCD30, anti-CD45, 

anti-CD54 og anti-CD68) samt de fleste p53 

antistoffer. 

HIER-teknikken bygger på opvarmning af 

afparaffinerede og rehydrerede paraffinsnit i 

passende buffer eller saltopløsning. Shi’s 

originale metode benyttede sig af mikrobølgeovn 

(MBO) som varmekilde og af en mættet 

blythiocyanatopløsning eller rent destilleret 

vand som “kogemedium”. Siden Shi’s 

originale arbejde er talrige modifikationer 

blevet publiceret. Cattoretti et al (20) introducerede 

i 1993 citratbuffer 0,01 M, pH 6, 

som kogemedium. Citratbuffer har siden været 

det mest benyttede kogemedium i HIER 

teknikken, men afløses nu i tiltagende omfang 

af alternative buffere (se nedenfor). 

Den præcise mekanisme bag HIER teknikken 

er ikke kendt. Meget tyder dog på at varmepåvirkningen 

af vævssnittene bl.a. har følgende 

indvirkning: 

a. Formaldehydinducerede tværbindinger 

(methenbroer) brydes. 

b. Komplekst bundne og epitopmaskerende 

Ca-ioner fjernes. 

c. Vævet rehydreres med forbedret penetration 

til følge. 

d. En vis proteindenaturering forekommer, 

hvilket kan blotlægge skjulte epitoper. 

Det skal her bemærkes, at formalinfiksering 

synes at have en beskyttende virkning mod 

denaturering af proteiner ved opvarmning - 

en proces, der ville denaturere ikke-fikserede 

proteiner. 

Der indgår i HIER-teknikken en række variabler, 

nogle med stor betydning og andre med 

mindre betydning for epitop demaskeringen: 

Varmekilde, temperatur og tid 

Som varmekilde er flere alternativer afprøvet. 

Mikrobølgeovn (MBO) med eller uden trykkoger, 

almindelig kogeplade, autoklave, ”steamer”, 

vandbad og trykkoger 

(19,20,24,25,68,69) er alle varmekilder, der 

med succes har været anvendt i HIER-teknikken. 

Det synes således ikke særligt kritisk, 

hvilken varmekilde der anvendes. Vigtigere 

end selve varmekilden er temperaturen i 

kogemediet, og den tid, snittene befinder sig 

deri (26,69). 

I den traditionelle HIER-teknik, hvor mikrobølgeovnen 

anvendes, opnås sædvanligvis tilfredsstillende 

epitopdemaskering efter kogning 

ved 100°C i 10 til 15 min. I autoklave, 

trykkoger, eller MBO-trykkoger er det p.g.a. 

trykket muligt at bruge temperaturer over 

100°C (115-120°C). Dette kan for visse epitoper 

give en mere effektiv demaskering. 

Leong et al (86) sammenlignede på 42 diagnostiske 

rutineantistoffer såkaldt ”superheating” 

(5 min. 120°C ved 1,9 bar i Milestone 

Mega T/T) med traditionel kogning i mikrobølgeovn. 

De fandt for ca. 30 af antistofferne 

kraftigere reaktioner efter ”superheating” end 

efter mikrobølgekogning. Lignende forsøg i 

eget lab (4) har ikke afsløret samme tydelige 

fordele ved ”superheating”. Mulige årsager 

kan være, at Leong primært brugte citratbuffer 

som kogebuffer og at kogetiden i mikrobølgeovn 

kun var på 10 min. I modsætning 

hertil har egne forsøg (4) været baseret på T- 

EG buffer pH9 (se afsn. vedr. kogemedium) 

og en kogetid på 15 min. i mikrobølgeovnen. 

En mindre forlængelse af kogetiden (samlet 

kogetid 15-20 min.) i mikrobølgeovnen kan 

øjensynligt give samme resultat som anvendelsen 

af ”superheating” (4,69) og være mere 

skånsomt ved vævet. 

”Cyklisk” kogning i form af 3-4 x 5 min hævdes 

for visse epitoper ligeledes at være mere 

effektiv end én sammenhængende kogeperiode 

(75), mens andre ikke har fundet nogen 

fordel herved. 

Det forhold, at lavere temperatur (T) kræver 

længere “kogetid” (t), understreges af Shi et 

al.’s (70) resultater med anti-Ki67, klon MIB1 

på tonsilvæv. Identisk og optimal demaskering 

af MIB1 epitopen blev opnået under følgende 

varmebehandlingsforhold (T x t): 

100°C x 20 min., 90°C x 30 min., 80°C x 50 

min., 70°C x 10 timer. Udover at kaste lys 

over nogle meget centrale forhold omkring 

HIER antyder disse resultater desuden, at 

epitopdemaskering ikke nødvendigvis altid 

behøver at foregå under egentlig kogning, 

men også kan foregå ved lavere temperaturer. 

Koopal et al.’s resultater (77) understøtter 

dette. I deres undersøgelse gav 16 af 16 

Mogens Vyberg 2005


antistoffer identiske eller kraftigere reaktioner, 

når demaskering blev foretaget natten 

over ved 80°C i Tris-HCl pH 9 

(“low-temperature HIER”) sammenlignet med 

MBO-kogning i Tris-HCl pH 9,5 + 5% urea. 

Den morfologiske bevarelse angives som 

værende god efter behandlingen natten over 

ved 80°C, men desværre uden nogen detaljeret 

sammenligning til de MBO-behandlede 

snit. Når HIER-behandling ved lavere temperaturer 

- på trods af en voldsom forlængelse 

af inkubationstiden i “kogemediet” - alligevel 

kan være interessant, hænger det netop 

sammen med problemer med den morfologiske 

bevaring af visse væv. Kogning og 

høje temperaturer i øvrigt får kollagene fibre 

til at “kvælde op” og dermed løsne sig fra 

glasset. Det er et fænomen, der ind i mellem 

kan give visse fortolkningsmæssige problemer 

specielt i bindevævsrige tumorer. Da 

tendensen til “kvældning” af kollagen aftager 

med faldende HIER-temperatur, er demaskering 

ved lavere temperatur som alternativ til 

MBO-kogning ikke uinteressant. Undersøgelser 

i eget laboratorium har vist (4), at 

kvældning af kollagen helt kan undgås, hvis 

HIER-behandlingen foregår ved max. 60ºC. 

Forlænges behandlingen samtidig til 20-24 

timer, opnås resultater, der oftes er lig med 

eller kun marginalt svagere end, hvad der 

opnås efter kogning. Disse fund er gjort med 

TEG-buffer som ”kogemedium” (se afsn. 

vedr. kogemedium) og har medført, at ved 

receptor undersøgelser (ER og PgR påvisning) 

på mammacancer har denne ”lowtemperature 

HIER” (se afsn. vedr. HIERprotokoller) 

været anvendt som rutinemetode 

i Odense siden 2000. Shi et al (88) viste, at 

HIER ved lavere temperaturer end 100°C ikke 

blot er et spørgsmål om at forbedre morfologien 

i snittene. Det kan også være nødvendigt 

for at opnå optimal demaskering af specielt 

”varme-sensitive” antigener/epitoper. 

Shi et al fandt med et pAb mod COX-2 

(PG27), at traditionel kogningsdemaskering i 

citrat buffer pH 6 gav negative resultater. 

Ved at sænke temperaturen i citrat bufferen 

til 90°C opnåedes derimod en meget god 

demaskering. Optimal demaskering blev opnået 

med inkubationstider på 30-120 min., 

mens inkubation natten over svækkede reaktionen 

voldsomt. Som konsekvens af disse 

fund anbefaler Shi et al. at inkludere en eller 

flere varianter af ”low-temperature HIER” i 

”test-batteriet” til sceening for optimal epitop 

demaskering (Tabel 2.1 og 2.2). 

Som nævnt synes valg af varmekilde ikke 

særlig kritisk. Den mikrobølgeinducerede 

varmebehandling er dog på mange måder 

den hurtigste og letteste måde at udføre 

HIER på. Da almindelige husholdnings-mikrobølgeovne 

er anvendelige, kræver 

denne teknik heller ikke den store investering. 

Problematikken omkring “hot-spots” og 

“cold-spots” i MBO-teknikken har været diskuteret, 

men synes uden betydning for reproducerbarheden, 

hvis den praktiske udførsel 

af HIER metoden standardiseres (se HIERprotokoller 

nedenfor). 


Figur 2.7: Intensiteten af immunreaktioner relateret 

til pH i kogemediet. Tre forskellige mønstre af 

pH-afhængighed har vist sig: Én gruppe antistoffer 

udviser kun ringe pH-relateret variation (A). En 

anden gruppe viser i svagt sure medier et dramatisk 

fald i intensitet (B), mens en tredje gruppe giver 

kraftigere reaktioner med et stigende pH. Efter Shi 

et al. (27). 

Firmaet BioCare har gennem udviklingen af 

deres såkaldte Decloaker bidraget til at gøre 

trykkogning til et attraktivt alternativ til mikrobølgekogning. 

Decloaker’en består af et 

lille trykkammer med indbygget elektrisk 

kogeplade. Den simple konstruktion gør instrumentet 

meget billigere end de fleste mikrobølgetrykkogere. 

Decloaker’en er til gengæld 

noget dyrere end både husholdningsmikrobølgeovne 

og traditionelle husholdnings-trykkogere. 

I forhold til traditionelle 

trykkogere burde resultaterne være mere 

reproducerbare med Decloaker på grund af 

det indbyggede program for opvarmning. 

Erfaringer i Aalborg tyder dog på, at en præcis 

kalibrering og dermed stabilitet kan være 

vanskelig at opnå med Decloaker. 

DakoCytomation har for nylig lanceret en 

tilsvarende trykkoger, Pascal. 

Uanset hvilken metode der anvendes til opvarmning, 

skal snittene efter kogning køle af i 

kogemediet, idet en direkte placering af glassene 

i kold PBS/TBS kan skade både 

vævsmorfologi og antigenisitet. 

Kogemedium 

Mange forskellige kogemedier har været afprøvet 

og anbefalet til HIER (26-29). Specielt 

2 generelle egenskaber ved kogemedierne 

synes at have en stor betydning for, hvor 

effektivt de fungerer i HIER-teknikken. Disse 

egenskaber er: 

1. Kogemediets pH. 

2. Kogemediets evne til at kompleksbinde 

eller udfælde calciumioner. 

Shi et al (27) fandt, at ændringer i kogemediets 

pH kan resultere i dramatiske forskelle i 

den demaskerende effekt. Efter at have undersøgt 

immunfarvning med et panel af mAbs 

(ialt 9) efter HIER i forskellige kogemedier 

med pH variende fra 1 til 10, fandt man tre 

forskellige mønstre af pH-afhængighed (Fig. 

2.7).


En gruppe på fem antistoffer viste ingen 

nævneværdig variation i farvningsintensiteten 

inden for hele pH-området. To antistoffer 

(anti-Ki67, klon MIB1; og anti-ERα, klon 1D5) 

viste en V-formet kurve med et dramatisk 

fald i farvningsintensitet efter HIER i buffer 

med pH 3-5. Ved lavt pH og højt pH var reaktionen 

kraftig. Endelig viste to antistoffer 

(anti-CD43, klon MT1; og anti-melanosoma 

specific antigen, klon HMB45) ingen reaktion 

ved lavt pH, men herefter en gradvis forstærkning 

af reaktionen med stigende pH i 

kogemediet. Undersøgelsen viste, at Tris-HCl 

ved højt pH er langt mere velegnet som generelt 

kogemedium end citratbuffer pH 6. 

Lignende resultater kommer andre studier til 

(28,70,72), omend det er værd at bemærke, 

at Tris-HCl ved pH 1 med nogle antistoffer 

(ex: anti-Ki67, klon MIB1) giver endnu bedre 

demaskering end Tris-HCl ved pH 10 (70) En 

kedelig ulempe ved Tris-HCl pH 1 er, at der 

ikke sjældent ses en svag falsk positiv reaktion 

i en del kerner! Ydermere synes den generelle 

morfologiske bevaring at være ringere 

efter kogning ved pH 1 end ved pH 10. 

Morgan et al (29,71) fandt, at kompleksbinding 

eller udfældning af vævsbundne calciumioner 

og muligvis andre divalente metal 

kationer er et kritisk step i HIER-teknikken. 

Som en konsekvens af dette må det antages, 

at en medvirkende årsag til maskering af 

epitoper er en tæt kompleksbinding af calciumioner 

og/eller andre divalente metal kationer 

til antigener (proteiner) under 

NBF-fiksering. Undersøgelsen viste med 

Ki67-antigenet og mAb MIB1 som udgangspunkt, 

at stærke kompleksbindere som EGTA 

og EDTA anvendt ved pH 8 er mere effektive 

til epitopdemaskering end den noget svagere 

kompleksbinder citrat. 

EDTA’s effektivitet på NBF- og B5-fikseret 

materiale er tydeligt blevet dokumenteret af 

Pileri et al. (72) Ud af 55 antistoffer, der 

kræver HIER, gav 1mM EDTA pH 8 i sammenligning 

med Tris-HCl pH 8 og citratbuffer 

pH 6 de bedste resultater med de 49. 

Siden 1996 er 2 modifikationer af Morgan’s 

EGTA/EDTA-HIER metode, gennem 2 uafhængige 

udviklingsarbejder, blevet rutine-demaskeringsmetode 

for flere og flere antistoffer. 

Brugen af T-EG buffer pH 9 (10mM 

Tris-base + 0,5mM EGTA) udspringer fra 

Patologisk Institut i Odense, mens TE buffer 

pH 9 (10mM Tris-HCl pH 9 + 1 mM EDTA) 

stammer fra Patologisk Institut i Aalborg. De 

2 buffere er uhyre effektive og giver stort set 

identiske resultater. I direkte sammenligning 

på 33 forskellige rutineantistoffer har T-EG 

buffer pH 9 og 1mM EDTA pH 8 givet noget 

nær den samme meget effektive demaskering 

(4). En uheldig egenskab, T-EG/TE bufferne 

deler med 1mM EDTA pH 8 og 0,1M 

Tris-HCl pH 10, er en voldsom forstærkning 

af falsk positiv reaktion som følge af endogen 

biotin. EGTA/EDTA-holdige buffere og Tris-- 

HCl ved højt pH er alle meget effektive til at 

demaskere endogen biotin. Det skal dog understreges, 

at problemet synes mindre med 

T-EG/TE end med 1mM EDTA pH 8. Dette 

sammen med en lidt bedre morfologi er de 

vigtigste argumenter for at vælge T-EG- eller 

TE-bufferen fremfor 1mM EDTA pH 8. 

Mange af de større antistofproducenter fremstiller 

og sælger HIER-buffere produceret ud 

fra mere eller mindre hemmelige recepter. 

Med én undtagelse synes ingen af disse “miksturer” 

at kunne noget i HIER-henseende, 

som ikke kan opnås ved anvendelse af 

T-EG/TE buffer, citrat buffer eller Tris-HCl 

buffer ved pH 1 eller pH 10. Undtagelsen er 

DakoCytomations “Target Retrieval Solution, 

pH 6,1” kode S1699/S1700 (TRS). Denne 

modificerede citratbuffer er med de fleste 

antistoffer mere effektiv med hensyn til demaskering 

end standard citratbuffer pH 6. Til 

gengæld er den overfor de fleste antistoffer 

langt mindre effektiv end specielt T-EG/TE 

buffer og Tris-HCl pH 10. Når TRS alligevel er 

værd at nævne, skyldes det, at det for et 

mindre antal antistoffer har vist sig, at være 

den eneste HIER buffer, der giver brugbare 

resultater (4, 74). Blandt disse antistoffer kan 

nævnes: anti-CD5, klon Leu-1; anti-CD21, 

klon 1F8; anti-CD27 klon 137B4; antiepithelial 

antigen, klon Ber-EP4; antiepithelial-related 

antigen, klon MOC-31; antiepidermal 

growth factor receptor, klon E30, 

og anti-serotonin, klon 5HT-H209. TRS har på 

nuværende tidspunkt været testet på i alt ca. 

350 forskellige primære antistoffer. I godt 20 

tilfælde er de bedste resultater opnået med 

netop TRS (4). 

TRS bør derfor indgå i det batteri af buffere, 

som afprøves når et nyt antistof tages i anvendelse 

(se afsn. 2.8.2). TRS er dyrere end 

både citrat og T-EG/TE buffer. Dog kan opløsningen 

angiveligt genbruges op til 20 gange 

(74). 

Flere studier har vist, at en kombination af 

proteolytisk forbehandling og HIER for nogle 

epitoper giver en mere effektiv demaskering, 

end hvis HIER eller proteolyse anvendes alene 

(74). Lignende fund er gjort i eget laboratorium 

(4). En del diagnostisk vigtige muskelmembran 

relaterede antigener er vanskellige 

at detektere tilfredsstillende i paraffinsnit. 

Epitoper på nogle af disse antigener 

har gavn af kombinations-demaskeringer som 

angivet i Tabel 2.2. Følgende antistoffer giver 

de bedste resultater med mild proteolyse 

efterfulgt af HIER i T-EG buffer (teknik 11): 

Anti-dystrophin klon DY4/6D3 og klon 34C5; 

anti-sarcoglycan delta, klon δ-Sarc/12C1; 

anti-myosin neonatal, klon WB-MHCn; antisarcoglycan 

beta, klon β-SARC/5B1; antisarcoglycan 

gamma, klon 35DAG/21B5; antispectrin, 

klon R8C2/3D5. Følgende antistoffer 

giver til gengæld de bedste resultater hvis 

HIER i citrat pH 6 efterfølges af mild proteolyse 

(teknik 12): Anti-caveolin 3, klon 26; 

Mogens Vyberg 2005


anti-dysferlin, klon Ham1/7B6; anti-laminin 

alfa5, klon 4C7; anti-myosin developmental, 

klon RNMy2/9D2 og anti-sarcoglycan alfa, 

klon Ad1/20A6. 

Det er således ved kombinationsdemaskeringerne 

ikke ligegyldigt, hvilken 

HIER buffer der anvendes, og hvilken rækkefølge 

de 2 demaskeringer gøres i! 

Både for HIER-teknikken og den proteolytiske 

forbehandling gælder, at der er en teoretisk 

risiko for at introducere nye krydsbindende 

sites i det forbehandlede væv. I praksis har 

det vist sig, at der sjældent introduceres 

krydsbindinger, der volder fortolkningsmæssige 

problemer. 

Forinden et nyt antistof med tilhørende epitopdemaskeringsteknik 

tages i brug i rutinesammenhæng, 

er en kritisk vurdering af positive 

reaktioner nødvendig, herunder evt. 

sammenligning med resultater opnået på 

frysesnit af de samme væv. For pAbs skal 

man også være opmærksom på, at forskellige 

demaskeringsteknikker kan favorisere forskellige 

af antistoffets kloner. Man kan således 

opleve, at S-100 pAb giver forskellige 

farveresultater efter proteolytisk og HIER 

forbehandling: Mens de fleste celler viser 

samme farveintensitet uanset forbehandlingen, 

vil nogle, fx follikulære dendritiske celler 

ved de almindeligt anvendte antistofkoncentrationer 

være S-100 negative efter proteolytisk 

forbehandling, men positive efter HIER. 

Tilsvarende forskel er set efter farvning af 

forskellige tumorer, fx gastrointestinal stromal 

tumor. 

HIER på cytologisk materiale 

Brugen af HIER-teknikken er ikke begrænset 

til paraffinsnit. Også inden for cytologien er 

der store anvendelsesmuligheder. Reynolds 

et al (30) fandt på smears og imprints, at 

reaktionen for 12 af 14 antistoffer kunne 

forstærkes ved HIER efter formalinfiksering. 

Blandt antistofferne, der gav kraftigere reaktioner, 

var vigtige antistoffer som anti-ERα, 

klon 1D5; anti-p53, klon PAb1801; anti-C-erbB2, 

pAb; anti-CD20, klon L26; og 

anti-CD45 (LCA), klon 2B11 og PD7/26. Undersøgelser 

i Odense og Aalborg føjer yderligere 

til denne liste: anti-PgR, klon ICA og 

klon PgR636; anti-CyclinD1, klon P2D11F11; 

og anti-Ki67, klon MIB1, anti-vimentin, klon 

3B4, anti-pan-CK, klon AE1/AE3, antimelanosoma 

specific antigen, klon HMB45; 

og anti-melan A, klon A103. Undersøgelserne 

viste også, at de bedste resultater som regel 

opnås på cytologisk materiale efter NBF fiksering, 

og at fikseringstid bør være minimum 

15 min. Ved kortere fikseringstid i NBF eller 

ved brug af svagere fiksativer som acetone 

og etanol er der en risiko for tab af cytologiske 

detaljer. 

Det gælder for det cytologiske materiale som 

for det histologiske, at der med alternative 


kogemedier kan opnås yderligere forbedringer 

sammenlignet med citratbuffer. Kogning i 

TRS giver for mange antistoffer betydeligt 

bedre resultater end citrat. Anvendes T- 

EG/TE buffer kan opnås yderligere forbedring 

mht demaskerende effekt. Desværre er den 

cytologiske bevaringsgrad efter kogning i en 

af disse buffere ikke god. Foretages demaskering 

i stedet ved lavere temperatur svarende 

til TEG95 protokollen (se nedenfor 

vedr. HIER protokoller) opnås foruden en 

yderst effektiv demaskering også god cytologisk 

bevarelse. I TEG95 protokollen bringes 

T-EG bufferen i kog i MBO, hvorefter bufferen 

tages ud af ovnen og prøvematerialet anbringes 

i den varme buffer 15 min. Specielt gode 

resultater er bl.a. opnået med anti-PgR, klon 

PgR 636; anti-ERα, klon 1D5 og klon 6F11; 

anti-tyrosinase, klon T311; anti-TTF-1, klon 

SPT24 og anti-synaptophysin klon snp88 (4). 

Væskebaseret cytologi (Liquid based cytologi, 

LBC) vinder i disse år mere og mere indpas 

indenfor patologien. I stedet for manuelt at 

udstryge prøvematerialet opsamles det i en 

alkoholbaseret præserveringsvæske, hvorfra 

der maskinelt kan produceres meget ensartede 

”aftryk” (ThinPrep eller AutoCytePrep), 

som efter alkoholfiksering (96% etanol eller 

spray-fix) kan anvendes til analyse. Teknologien 

er primært udviklet til cervix-cytologisk 

materiale, men kan anvendes til de fleste 

cytologiske materialer. Immuncytokemiske 

undersøgelser kan med fordel udføres på 

ThinPrep og AutoCytePrep. En forudsætning 

er naturligvis for de enkelte antistoffer at 

finde de optimale fikserings- og HIERbetingelser. 

Forsøg i eget laboratorium med 

21 diagnostiske rutineantistoffer og 6 forskellige 

”fikserings-HIER” protokoller viste, at 

TEG100 protokollen for de 19 antistoffer gav 

klart de bedste resultater. Blandt de 19 antistoffer 

var anti-ERα, klon 6F11; anti-Ki67, 

klon MIB1; anti-TTF1, klon SPT24; anti-CK, 

klon AE1+AE3: anti-vimentin, klon V9; anti- 

CD45, klon 2B11+PD7/26. Cellernes ophold 

(fra timer til dage) i præserveringsvæsken og 

den efterfølgende alkoholfiksering nødvendiggør 

en mere effektiv HIER behandling end 

blot kogning i citratbuffer eller behandling i 

95°C varm T-EG buffer. I TEG100 protokollen 

koges materialet 15 min i T-EG buffer. Den 

forlængede fiksering i alkohol gør, at den 

cytologiske bevaringsgrad af cellerne er god, 

selv efter kogning i T-EG buffer. 

HIER teknikken kan også med nogen succes 

anvendes som forbehandling til immuncytokemiske 

undersøgelser på Papanicolau- eller 

Giemsafarvede smears. HIER er i stand til at 

demaskere en del antigener i de farvede 

smears, samtidig med at den er effektiv til at 

affarve cellerne. Identifikation af Ki67antigenet 

med klon MIB1 i Papanicolaufarvede 

smears har bl.a. vist sig nyttig til at 

skelne mellem normale celler og carcinoma in 

situ i atrofiske cervix smears (31). For at 

bevare cytologiske detaljer i smearet anbefales 

det at fiksere de rehydrerede celler i 4% 

NBF i 15 min. før HIER iværksættes (4).


Tabel 2.1: ”Test-battery” til screening for optimal 

HIER-teknik, efter Shi et al. (73). 

Buffer a pH1 pH6 pH10 

120ºC, 10 min b Snit#1 Snit#4 Snit#7 

100ºC, 10 min. Snit#2 Snit#5 Snit#8 

90ºC, 10 min. Snit#3 Snit#6 Snit#9 

a10mM Tris-HCl anvendes ved pH 1, 10mM Citrate 

ved pH 6 og 100 mM Tris-HCl ved pH 10. 

b 120ºC opnås ved hjælp af autoklave eller trykkoger. 

Samme effekt kan opnås ved forlænget MBO-kogning 

(20 min.). 

I tidligere Giemsa farvede præparater er 

mange antigener specielt vanskelige at påvise. 

Her kan citratbufferen med fordel erstattes 

med TE/T-EG buffer. Tilfredsstillende resultater 

er således opnået på Giemsapræparater 

med anti-Ki67, klon MIB1; og anti-ERα, 

klon 1D5; efter 15 min. MBO-kogning i T-EG 

buffer (med forfiksering 15 min. i 4% NBF). 

Der er dog ved denne teknik risiko for falsk 

negative reaktioner, som kan være vanskelige 

at identificere! 

HIER og standardisering 

Med introduktionen af varmebaseret epitop 

demaskering først i 90’erne og specielt med 

lanceringen af den citratbuffer-baserede teknik 

syntes mulighederne gode for en øget 

standardisering indenfor immunhistokemien. 

Der var en overgang et begrundet håb om, at 

én standard HIER procedure kunne konstrueres. 

Denne skulle udviske alle fikseringsprocedurens 

varierende påvirkninger (maskeringer) 

af antigene epitoper og hermed fjerne et 

væsentlig grundlag for de resultatmæssige 

uoverensstemmelser, som den immunhistokemiske 

litteratur desværre er præget af. Nu 

5-6 år senere synes udviklingen ikke entydigt 

at have bragt os nærmere en standard HIER 

teknik, der kan bruges til alle antistoffer - 

tværtimod er udbuddet af HIER modifikationer 

næsten endeløs. Når vi alligevel i dag er 

tættere på en vis form for standardisering 

indenfor HIER-teknikkerne end for 5-6 år 

siden, skyldes det især et par forskergruppers 

ihærdige og metodiske arbejde med at afdække 

de enkelte parametres betydning for 

HIER-teknikken (27,29). I dag bør HI- 

ER-standardiseringen tage udgangspunkt i, at 

der ikke findes én HIER metode, der er optimal 

for alle antistoffer (epitoper). I stedet bør 

de enkelte laboratorier i højere grad standardisere 

måden hvorpå de tester nye (og gamle!) 

antistoffer på. Shi et al (70, 73) anbefaler 

at HIER-standardisering tager udgangspunkt i 

at fastlægge, hvad de betegner som “maximal 

retrieval” (maksimal demaskering) for et 

givet antistof ved hjælp af et “HIER 

test-battery” omfattende de vigtigste HIER 

parametre: pH, temperatur og tid (Tabel 

2.1). Den HIER-teknik, der giver maximal 

retrieval, bør herefter anvendes rutinemæssigt 

til det pågældende antistof. 

Et lignende “test-batteri” har været i brug i 

eget laboratorium siden 1996 med succes 

(Tabel 2.2). “Test batteriet” til sceening for 

optimal epitop retrieval indeholder foruden de 

vigtigste elementer fra Shi’s “test batteri” 

også non-HIER teknikker og vigtige HIER 

parametre ( bl.a. calcium kompleksbinding), 

der ikke er med i Shi’s initiale batteri. 

HIER protokoller - MBO-teknik 

Protokol A - Traditionel “cyklisk” kogning af 1 

slideholder (24 glas). 

1. Snit anbringes i grå 24 stk’s Tissue—Tek slideholders. 

Evt. tomme pladser fyldes med blanke 

objektglas. Slideholder anbringes i Tissue-Tek 

farveskål med 250 ml kogemedium. 

2. Farveskål med snit anbringes centralt i mikrobølgeovnen. 

Der koges 5 min. med effekt på 

600 - 700 W 

3. Fordampet medium erstattes ved efterfyldning 

med destilleret vand. Der koges 5 min. 

4. Trin 3 gentages (ved forlænget kogetid gentages 

trin 3 det nødvendige antal gange). 

5. Efter kogning anbringes kogemedium med snit 

på bordet til nedkøling 15 min. 

6. Skyl i buffer og fortsæt farvningsproceduren. 

Protokol B - Kogning af 3 slideholders (72 

glas). 

Protokol B foretages med 3 fyldte Tissue Tek 

slideholders i 3 Tissue Tek farveskåle med 

250 ml kogemedium. Protokol B gør det muligt 

at foretage 3 forskellige kogeprocedurer 

på én gang. Det være sig kogning i 3 forskellige 

buffere eller kombinationen af 2 farveskåle 

med en rutinemæssig 15 min. kogning 

og 1 farveskål med en forlænget 25 min. 

kogning. I tilfælde hvor der ikke er behov for 

3 farveskåle med kogebuffer, “fyldes der op” 

med farveskål(e) med dest vand og slideholder(s) 

med blanke glas således, at mængden 

af kogemedium og glas altid er den samme. 

Protokol B kræver at mikrobølgeovnen er 

udstyret med drejeplade. 

1. Snit anbringes i grå 24 stk’s 

Tissue—Tek slideholders. Evt. 

tomme pladser fyldes med 

blanke objektglas. Slideholder 

anbringes i Tissue-Tek farveskål 

med 250 ml kogemedium. 

3 farveskåle anbringes 

perifert på drejepladen i mikrobølgeovnen, 

som angivet på figuren. 

2. Start mikrobølgeovnen på fuld effekt (700- 

900W) med drejepladen aktiveret. Notér tidspunktet 

for hvornår kogemedierne kommer i 

kog. Dette gøres de første gange metoden bruges, 

herefter kendes opvarmningtiden, der er 

nødvendig for den enkelte ovn. Denne tid kan 

bruges efterfølgende. For en Moulinex Y51 med 

effekt 900W skal bruges 11 min. for at bringe 3 

farveskåle i kog. 

Mogens Vyberg 2005


3. Når alle 3 kogemedier er bragt i kog, nedsættes 

effekten således, at væskerne “simrekoger”, 

kogningen fortsætter i 15 min. For hver enkelt 

mikrobølgeovn må dette effekttrin fastlægges 

via forsøg med blanke glas. Målet er, at væskerne 

koger mest muligt uden at koge for meget 

over (tab af væske). For en Moulinex Y51 er 

det optimale effektrin for “simrekogning” 400W. 


på bordet til nedkøling 15 min. Fortsæt til trin 

7. 

5. En evt. farveskål med snit, der skal koges 25 

min., flyttes nu til midten af ovnen og der koges 

yderligere 10 min. på et extra nedsat effektrin 

(skal igen fastlægges via forsøg for den 

enkelte ovn). For en Moulinex Y51 er det optimale 

effekttrin 170W. 


på bordet til nedkøling 15 min. 


Protokol C - 24 timers “Low-temperature 

HIER” 

1. Snit anbringes i grå 24 stk’s Tissue-Tek slideholder. 

Evt. tomme pladser fyldes med blanke 

objektglas. Slideholder anbringes i Tissue-Tek 

farveskål med 250 ml kogemedium. 

2. Farveskål med snit anbringes i varmeskab ved 

60°C. Inkubationtid 24 timer. 

3. Efter varmebehandlingen anbringes farveskål 

med snit på bordet til nedkøling 15 min. 


NBF-HIER protokoller til cytologisk materiale 

”Citrat protokol” og ”TRS protokol” 

1. NBF 4% 15 min 

2. Ethanol 96% skyl 15 sek 

3. Ethanol 96% 10 min 

4. Rindende vand 5 min 

5. Kogning i citratbuffer eller TRS 

(Protokol B) 

15 min 

”TEG100 protokol” 

1. NBF 4% 15 min 




5. Kogning i T-EG buffer 

(Protokol B) 

15 min 

”TEG95 protokol” 

1. NBF 4% 15 min 




5. Demaskering i T-EG buffer ved 95°C (a) 15 min 

(a) Objektglas anbringes i grå 24 stk’s Tissue-Tek 

slideholder. 


Evt. tomme pladser fyldes med blanke objektglas. 

250 ml T-EG buffer i Tissue-Tek farveskål bringes 

til kogning i mikrobølgeovn. Farveskålen fjernes fra 

ovnen og stilles på bordet og slideholder med præparaterne 

anbringes straks i den varme buffer (ca. 

95°C). Efter demaskering skylles i rindende vand. 

Dehydreringen/fikseringen i ethanol efter NBF 

betyder, at chromogen-udfældningen i cellerne 

bliver mere homogen (ligner hvad der 

opnås på paraffinsnit) end, hvis dette trin 

udelades. Uden ethanol bliver reaktionsproduktet 

specielt med AEC meget granulært! 

Udvalgte HIER buffere 

T-EG buffer pH 9, 10mM+0,5mM 

Tris (Sigma T-1378) 1,211 g 

EGTA “Titriplex VI” (Merck 8435) 0,190 

Dest. vand 1000 ml 

Opløsningen behøver ingen pH-justering. pH er 

normalt mellem 8,95 og 9,1 

TE buffer pH 9, 10mM+1mM 

Tris (Sigma T-1378) 1,211 g 

EDTA ”Titriplex III” (Merck 8418) 0,372 g 


Opløsningen behøver ingen pH-justering. pH er 

normalt mellem 8,90 og 9,05 

Citrat buffer 10mM, pH 6 

Citronsyre, monohydrat 2,1 g 


pH justeres til 6,0 med 2M NaOH. 

Tilsæt destilleret vand til 1000 ml 

EDTA 1mM, pH 8 

EDTA ”Titriplex III” (Merck 8418) 0,372 g 


pH justeres til pH 8,0 med 1M NaOH. 

2.7 Blokering af uspecifik 

antistofadhæsion 

Såkaldt uspecifik baggrundsfarvning kan i 

visse tilfælde volde problemer i immunhistokemiske 

teknikker. Problemet ses oftest 

ved anvendelse af pAb med ringe aviditet 

(“affinitet”). Årsagen til denne baggrundsfarvning 

er, at immunglobuliner udover den 

specifikke interaktion med antigene epitoper 

også er i stand til at binde sig til vævsproteiner 

ved hjælp af svagere, uspecifikke bindinger. 

Antistofmolekyler vil specielt kunne adhærere 

til vævssnittet gennem elektrostatisk 

tiltrækning og hydrofob interaktion. 

Den traditionelle måde at imødegå uspecifik 

antistofadhæsion er dels gennem forbehandling 

med “blocking protein” og dels tilsætning 

af “blocking protein” til antistofopløsningerne.


Ved at præinkubere med proteinopløsning 

opnås en blokering af vævsproteinernes mulighed 

for bl.a. hydrofob interaktion med antistofmolekyler. 

Valg af proteinopløsning er 

naturligvis vigtig. Proteinet skal være i stand 

til at konkurrere effektivt med IgG-molekyler 

med hensyn til hydrofob interaktion. Tidligere 

anvendtes næsten udelukkende sera fra ikke-immuniserede 

dyr (“normal sera”) til denne 

forbehandling. Betydningen af denne forbehandling 

er aftaget i takt med udviklingen 

af bedre antistoffer og visualiseringsteknikker. 

I nogle tilfælde ses normalserum faktisk 

at give en forøgelse af baggrundsfarvningen! 

I dag anvendes i vid udstrækning bovint serum 

albumin (BSA), casein opløsninger 

og/eller detergentia (fx Triton X-100 og 

Tween 20), ikke alene som forbehandling, 

men også som tilsætning til fortynderbuffere. 

Casein synes specielt at være et godt og effektivt 

universalmiddel til blokering af uspecifik 

antistofadhæsion (32). 

Protokoller til blokering af uspecifik antistofadhæsion: 

1. Casein 0,5 % i PBS eller TBS 10-20 min. 

eller 

2. Normal serum, 5 % i PBS eller TBS 10 min. 

eller 

3. BSA, 2 % i PBS eller TBS 10 min. 

eller 

4. Detergent (Tween 20 eller Triton X-100), 0,25 % 

- 1 % i PBS eller TBS 10 min. 

Ved brug af mAbs og gode oprensede pAbs 

(Ig-fraktion eller bedre) i de gængse detektionssystemer 

er BSA forbehandling eller 

grundig vask i buffer med detergent (jvf. 

protokol 4) sædvanligvis fuldt tilstrækkeligt. 

Disse forbehandlinger kombineres sædvanligvis 

med tilsætning af 1 % BSA til antistof 

opløsningerne. Anvendes fuldsera antistoffer 

eller benyttes ekstremt følsomme detektionssystemer 

som TSA (afsn. 2.10.2) stilles ofte 

større krav til blokering af antistof-adhæsion. 

I disse tilfælde bør casein anvendes. 

Blokering af Fc-receptorer 

Fc-receptorer er membranproteiner, der binder 

sig til Fc-delen på antistofmolekyler med 

en forholdsvis høj bindingsstyrke. 

Fc-receptorer findes fortrinsvis på granulocytter 

og makrofager. Uspecifik baggrundsfarvning 

på grund af antistoffers binding til 

Fc-receptorer ses normalt ikke på paraffinsnit. 

Formalinfiksering og vævspræparation 

ændrer Fc-receptorerne, således at de normalt 

ikke længere er i stand til at binde antistofferne. 

På acetonefikserede frysesnit og 

cytologisk materiale kan problemet til gengæld 

ses. Generelt volder det ikke de store 

problemer, men i makrofag-rige cytologiske 

materialer såsom bronkio-alveolær lavage 

(BAL) væsker kan den Fc-receptor betingede 

reaktion være generende. Problemet er især 

tydeligt, hvis der anvendes mAbs af subklasserne 

IgG2a (fx anti-CD20, klon L26; og anti-CK20, 

klon Ks20.8) eller IgG3. Dette skyldes, 

at især disse subklasser af muse IgG 

bindes til visse humane Fc-receptorer (52). 

Problemet med Fc-receptorer kan undgås ved 

at anvende F(ab’)2 fragmenter af antistofferne 

(både primære og sekundære antistoffer) i 

stedet for hele IgG-molekyler. En simpel alternativ 

løsning på problemet, der normalt 

virker tilfredsstillende, er at forbehandle med 

5% humant immunglobulin inden inkubation 

med primært antistof. Fc-receptorerne i prøvematerialet 

binder Ig og blokeres herved. I 

visse tilfælde kan det være nødvendigt også 

at inkludere 1% humant Ig i antistofopløsningerne. 

2.8 Primært antistof 

2.8.1 Valg af antistof 

Udbudet af kommercielle antistoffer er 

enormt, og der kommer hver dag nye til. Det 

kan derfor være vanskeligt at vælge hvilke(t) 

antistof(fer), man skal købe til påvisning af et 

givet diagnostisk interessant antigen. Gennem 

opslagsværker som Linscott’s Directory 

(33) og Manufacture’s Specifikations & Reference 

Synopsis (”MSRS”) (34) vil det være 

muligt at få et rimeligt overblik over udbudet 

og hvem, der producerer/forhandler de pågældende 

antistoffer. På trods af opdateringsblade 

mv. forældes disse opslagsværker 

hurtigt. On-line versionerne på internettet er 

derfor at foretrække. 

www.antibodies-probes.com 

På denne adresse finder man MSRS’s on-line 

database med data på mere end 165.000 

kommercielle primære antistoffer. Databasen 

er brugervenlig med i alt 11 forskellige søgefelter. 

Den opdateres løbende og kan på trods 

af et årligt abonnement på 98 USD anbefales. 

En gratis demo-version af databasen er tilgængelig 

på samme adresse. Linscott’s Directory’s 

on-line version findes på adressen: 

www.linscottsdirectory.co.uk 

Databasen indeholder mere end 100.000 

forskellige produkter, overvejende primære 

antistoffer. Det koster på årsbasis 75 USD at 

abonnere på den service. En gratis demoversion 

af databasen er tilgængelig på adressen. 

Databasen er ikke så stor og knap så 

brugervenlig som MSRS databasen. Til gengæld 

indeholder den andet end primære antistoffer. 

Blandt internettets mange gratis glæder findes 

også mange websites, der mere eller 

mindre er helliget antistoffer og immunhistokemi. 

Blandt disse kan følgende varmt anbefales: 

Mogens Vyberg 2005


SciQuest er et internetfirma, der har specialiseret 

sig i formidling af køb og salg af ”Scientific 

Products”. På firmaets website: 

www.sciquest.com 

findes on-line databasen ”AntibodyResource” 

med mere end 120.000 antistoffer fra de 

fleste større antistofproducenter. Tjenesten 

er gratis, men kræver log in med bruger id og 

password. Firmaet abcam, 

www.abcam.com 

der bl.a. lever af at sælge antistoffer over 

internettet, har en meget kraftfuld søgetjeneste, 

der ikke alene søger hos abcam selv, 

men også i andre antistofproducenters online 

kataloger. Denne søgemaskine er meget 

enkel og populær. 

Et par meget brugbare databaser hver med 

40-60.000 antistoffer findes hos: 

BioCompare: 

www.biocompare.com 

LabVelocity: 

www.researchlink.labvelocity.com 

Bag adressen: 

www.antibodyresource.com 

gemmer sig en privat hjemmeside med et 

væld af nyttige links til andre internetadresser 

med antistoffer som hovedemne. Der er 

således links til mere end 250 on-line firmaer, 

der sælge antistoffer. Hos de fleste af disse 

firmaer er det muligt via lokale databaser at 

finde datablade og andre oplysninger frem på 

firmaets produkter. 

Også adressen 

www.immunoquery.com 

giver mulighed for at finde antistoffer i forbindelse 

med opstilling af immunhistokemiske 

algoritmer. Den er gratis at bruge, men kræver 

password (der fås på samme adresse). 

På NordiQC’s hjemmeside: 

www.nordiqc.org 

publiceres resultaterne af de kvalitetssikrings 

runder, som IHC-laboratorier i Norden tilbydes 

at deltage i. Hvert år tilbydes 3 runder, 

hver med detektion af ca. 5 forskellige epitoper. 

Hjemmesiden indeholder en hastigt voksende 

database med detaljerede beskrivelser 

af diagnostisk vigtige epitoper. Optimale protokoller 

fra de enkelte kvalitetssikringsrunder 

kan frit downloades. Denne hjemmeside er et 

”must” for laboratorier, der beskæftiger sig 

med diagnostisk immunhistokemi. 

Med datablade, litteratur-referencer og anden 

information om de pågældende antistoffer i 

hånden er det så op til den enkelte bruger at 

vurdere, hvilke af antistofferne der kan være 


brugbare til den påtænkte applikation. Blandt 

de brugbare antistoffer skal herefter vælges 

det ”bedste” antistof. Det sidste er ofte umuligt 

at få en uvildig vurdering af. Er ressourcerne 

tilstede, er det bedste, man kan gøre, 

at kontakte producenterne med henblik på at 

få en lille gratis prøve. Man kan således uden 

omkostninger til antistof-indkøb teste og 

eventuelt sammenligne flere forskellige antistoffer 

mod det antigen, der ønskes undersøgt. 

2.8.2 Afprøvning af antistoffer 

Erhverves et nyt antistof, skal der altid foretages 

en grundig afprøvning, inden det anvendes 

i diagnostisk sammenhæng. Der bør 

være to klare mål med afprøvningen af antistoffet: 

1. Procedureteknisk optimering (fortynding, 

epitop demaskering, fiksering, mv). 

2. Vurdering af antistoffets reaktivitet og 

specificitet. 

Afprøvningen af antistoffet bør foretages med 

det eller de detektionssystemer, som laboratoriet 

normalt anvender og tage udgangspunkt 

i de præparationstyper, som antistoffet 

tænkes anvendt på. Paraffinsnit vil i de fleste 

tilfælde være det primære applikationsområde, 

alligevel må det anbefales også at inkludere 

frysesnit af relevante væv, især når det 

drejer sig om antistoffer, der ikke er veldokumenterede. 

Dette åbner mulighed for en 

sammenligning af resultaterne på de to forskellige 

præparationstyper. Det er selvfølgelig 

vigtigt, at reaktiviteten af antistoffet er den 

samme på de to præparationstyper. Er dette 

ikke tilfældet, skal det registreres og årsagen 

evt. findes. I praksis vil en del antistoffer give 

svagere reaktioner på paraffinsnit end på 

frysesnit. Ligeledes vil nogle antistoffer give 

svagere reaktioner på cryosnit end på paraffinsnit. 

Et mindre antal nyere mAbs (bl.a.: 

anti-CD5, klon 4C7; anti-CD2, klon AB75; 

anti-CD13, klon 38C12 og anti-CD14, klon 7), 

der fungerer godt på paraffinsnit, kan således 

ikke anvendes på cryosnit. 

Intensitetsforskelle i reaktionen i de to præparationstyper 

er i sig selv ikke nødvendigvis 

nogen katastrofe. Det vigtigste er, at der 

opnås det samme reaktionsmønster på de to 

præparationstyper (de samme celler/strukturer 

skal være positive/negative) og at 

reaktionsmønstret sammenholdes med og 

fortolkes i sammenhæng med de i litteraturen 

beskrevne resultater. 

Materiale til antistofafprøvninger 

1. Paraffinsnit af multiblokke/tissue 

microarrays 

2. Frysesnit 

3. Cytologisk materiale.


Anvendelsen af større multiblokke (35-38) 

eller tissue microarrays (91) giver gode muligheder 

for på én gang at optimere den tekniske 

brug af antistoffet og samtidig vurdere 

antistoffets reaktivitet overfor en lang række 

normale og patologiske væv. Anvendelse af 

multiblokke i afprøvningen af nye antistoffer 

er derfor meget vigtig. 

Parametre til afprøvning på paraffinsnit 

1. Fikseringstiden i NBF (6 - 168 timer) 

2. Epitop demaskering. 

Medtages tonsilvæv fikseret henholdsvis 6, 

24, 48 og 168 timer i multiblokkene, er det 

muligt for de fleste antigeners vedkommende 

at undersøge fikseringstidens betydning for 

antigenisiteten. Et brugbart alternativ til tonsilvæv 

er fx tyndtarm. 

Det er uhyre vigtigt at få fastlagt den optimale 

epitop demaskering for alle nye antistoffer 

(Tabel 2.2 og afsn. 2.6.2). 

Parametre til afprøvning på frysesnit og 

cytologisk materiale 

a. Acetone 10 min. 

b. 4% NBF 2 - 30 min. 

c. Acetone/metanol (1:1) 30 - 90 sek. 

d. På cytologisk materiale bør NBF-fiksering 

kombineret med detegent forbehandling 

(se afsn. 2.4.3) og NBF-fiksering kombineret 

med HIER (se afsn. 2.6.2) også afprøves. 

På frysesnit og cytologisk materiale er det 

vigtigt at finde den fikseringsprotokol og forbehandlingsprotokol, 

der giver de bedste 

resultater med det pågældende antistof. De 

nævnte fikseringer samt producentens anbefalede 

protokol bør som minimum afprøves. 

Opnås der ikke tilfredsstillende resultater 

med en af disse protokoller, må alternative 

fiksativer undersøges (se afsn. 2.4.3). 

2.8.3 Antistof-inkubation 

Inkubation med primært antistof og de øvrige 

immunoreagenser foregår normalt ved at 

pådryppe horisontalt lejrede materialer en 

passende mængde reagens (50-200µl). Før 

antistoffet appliceres, tørres overskydende 

væske bort omkring materialet og der etableres 

evt. en hydrofob barriere ved hjælp af 

fedtstift (DAKO-Pen eller lignende). Den hydrofobe 

barriere sikrer, at antistoffet ikke 

“løber af”. For at undgå fordampning og udtørring 

skal inkubationen foregår i fugtkammer. 

Materialet må på intet tidspunkt udtørre. 

Selv udtørring af paraffinsnit umiddelbart 

efter endt afparaffinering har vist en tydelig 

negativ effekt på flere membranlokaliserede 

antigener. 

Den traditionelle “dråbe-inkubation” er, på 

grund af den gentagende håndtering af det 

enkelte præparat, meget arbejdskrævende, 

men kan ikke for det primære antistof undgås 

uden automatisering (se nedenfor). Derimod 

kan man ved daglig farvning af store batches 

opnå en rationalisering ved at applicere detektionssystemet 

via farvevugger (racks) i 

større farveskåle (39,40). 

Automatisering 

Automatisering af hele farvningsproceduren 

er selvfølgelig den ultimative løsning på den 

omfattende håndtering af præparaterne. 

Mange firmaer tilbyder forskellige løsninger, 

der automatiserer mere eller mindre af farvningsproceduren. 

Fire firmaer dominerer pt 

verdensmarkedet for immunostainers: Bio- 

Genex, LabVision, Ventana og Dako- 

Cytomation. 

LabVision og DakoCytomations ”AutoStainer” 

og BioGenexs ”i6000” minder meget om hinanden. 

Begge er åbne systemer, der arbejder 

med horisontalt lejrede objektglas og en 

computerstyret robotarm med dispensor, der 

applicerer alle immunoreagenserne. Fælles 

for disse immunostainers er desuden, at de 

ikke kræver specielle reagenser eller utensiler. 

Kapaciteten på instrumenterne er moderat: 

BioGenex i6000 kan håndtere 60 objektglas. 

DakoCytomations Autostainer klarer 48 

glas ad gangen, mens LabVisions Autostainer 

fås til 36, 48 eller 72 glas. Eridan - et helt nyt 

fuldautomatisk instrument fra DakoCytomation 

med introduktion i 2005 - fås med en 

kapacitet på 60 glas. 

Ventana har flere instrumenter: TechMate500, 

NexES, BenchMark og Discovery. 

BenchMark og Discovery er avancerede instrumenter 

med en kapacitet på henholdsvis 

30 og 20 glas. Kapaciteten er ikke høj, til 

gengæld kan hele den immunhistokemiske 

protokol (og ISH protokoller) automatiseres. 

Begge instrumenter har separat temperaturregulering 

af objektglas, hvilket gør såvel 

afparaffinering som epitopdemaskering mulig. 

Ulempen ved disse instrumenter er dels, at 

man mere eller mindre er bundet til at bruge 

Ventanas reagenser, hvilket betyder, at analyseprisen 

bliver noget højere end på de konkurrerende 

”åbne systemer”, dels har vanskeligere 

ved at optimere sine protokoller. 

TechMate500 er en helt anden type instrument. 

TechMate500, der i Europa tidl. blev 

forhandlet af DakoCytomation, virker efter 

kapillærprincippet (7). Dette system kræver, 

at vævssnit eller cytologisk materiale monteres 

på specielle ”capillary—gap” slides, og at 

man bruger specielle ”pads” (filtrerpapir) til 

at fjerne immunoreagenser fra kapillærrummet 

igen. Nødvendigheden af specielle glas 

og pads er med til at fordyre analysen på 

dette instrument. TechMate500 er i stand til 

Mogens Vyberg 2005


samtidigt at håndtere 2-4 ”slideholders” med 

hver max. 60 glas. Farvningskapaciteten er 

med andre ord væsentlig højere på Tech- 

Mate500 end på de øvrige instrumenter. 

Hvilken immunostainer, et laboratorium bør 

vælge, hænger naturligvis sammen med laboratoriets 

størrelse og struktur, samt hvor 

mange og hvilke analyser maskinen dagligt 

skal udføre. 

2.8.4 Antistoftiter, inkubationstid og 

temperatur 

Den optimale antistoftiter (fortynding) er - 

foruden detektionssystemet (se afsn. 2.10) 

og kromogenet (se afsn. 2.11) - stærkt afhængig 

af inkubationstiden, samt af den 

temperatur hvorved inkubationen foregår. 

Mange laboratorier inkuberer 30-60 min ved 

stuetemperatur, nogle bruger 16-20 timer 

(natten over) ved 4° C. Der er en klar økonomisk 

fordel at inkubere længere end 30 

min, idet de fleste antistoffer kan fortyndes 

yderligere. Fortyndingen ved 30 min’s - 

inkubation kan multipliceres med 2-5 ved 

forøgelse af inkubationstiden til 1-2 timer, og 

med 4-10 ved 16 timers inkubation. Ydermere 

vil signal/støjforholdet, specielt for 

mange pAbs, forbedres betydeligt ved længere 

inkubation. Den yderligere fortynding af 

antistoffet nedsætter nemlig risikoen for 

uspecifik adhæsion til vævsproteiner. Endelig 

medfører en længere inkubationstid, at den 

variation i inkubationstiden, der nødvendigvis 

opstår ved manuel pådrypning af antistof, får 

relativt mindre betydning. 

Fordelen ved at anvende en relativt kort inkubationstid 

er naturligvis, at immunfarvningen 

kan færdiggøres hurtigere, ideelt samme 

dag som den er rekvireret. Da de fleste immunostainere 

samtidig fungerer bedst med 

inkubationstider på maksimalt 60 min, er det 

ikke overraskende, at de fleste diagnostiske 

rutinelaboratorier anvender inkubationstider 

på 30-60 min. 

Inkubationstider på væsentligt under 30 min. 

kan opnås ved at hæve inkubationstemperaturen 

til 37° C eller mere - ikke alene 

for det primære antistof, men også for visualiseringssystemet. 

Dette kan dog være forbundet 

med en større risiko for uspecifik 

baggrundsfarvning. 

Interessen for at nedsætte inkubationstiden 

til et minimum er tæt forbundet med ønsket 

om - i specielle tilfælde - at kunne supplere 

traditionel frysesnitsundersøgelse med immunhistokemi. 

Listen over hasteteknikker, 

der kan anvendes peroperativt, er forholdsvis 

lang. Blandt de mest interessante er klart 

metoderne fra Chilosi et al. (41) og Kämmerer 

et al. (83). Chilosi’s teknik er en simpel 

og hurtig ét steps metode, der bygger på 

anvendelsen af ”Enhanced Polymer One-step 

Staining” (EPOS, se afsn. 2.10.1) reagenser 

og opvarmning i mikrobølgeovn. Teknikken 


Tabel 2.3: Fortyndervæsker til primære 

antistoffer 

a. 1% BSA i 0,05 M tris-HCl-buffer pH 7,4 med 

0,15 M NaCl og 15 mM Na-azid. 

b. 1% BSA i 0,05 M tris-HCl-buffer pH 6,0 med 

15 mM Na-azid. 

c. 1% BSA i 0,05 M tris-HCl-buffer pH 8,6 med 

15 mM Na-azid. 

d. 1% BSA i 0,05 M tris-HCl-buffer pH 7,4 med 


e. 0,5% Casein i 0,05 M tris-HCl-buffer pH 7,4 med 


f. 1% BSA i 0,05 M tris-HCl-buffer pH 7,4 med 


Detergent i form af Tween20, 0,05%-0,1% kan med 

fordel tilsættes. 

gør det muligt på frysesnit fx at skelne lymfomer 

fra lavt differentierede carcinomer ved 

hjælp af CD45- og CK-farvninger udført på 

under 10 min! Ulempen ved metoden er, at 

den i sagens natur kun kan udføres med primære 

antistoffer, der findes i EPOS format 

(kun ca. 30 forskellige primære antistoffer 

findes i EPOS format). Kämmerer et al.’s 

metode er en 2-lags EnVision+ baseret metode 

(se afsnit 2.10.2) og dermed langt mere 

fleksibel, hvad angår valgt af primære antistoffer. 

Alle inkubationer foregår på varmeplade 

ved 37°C. Herved nedbringes den samlede 

farvetid til ca. 15 min. I forhold til Chilosis 

metode svarer dette dog til en forlængelse 

på ca. 5 min. Til gengæld er Kämmerers metode 

mere sensitiv (4) og pt det bedste bud 

på en peroperativ hasteteknik (se Haste- 

EnVision+, afsnit 2.10.2). 

Før et nyt antistof kan tages i brug, skal det 

titreres. En række forskellige fortyndinger af 

antistoffet skal afprøves i det detektionssystem, 

som antistoffet skal anvendes i. 

Normalt vil producenten anbefale, at antistoffet 

anvendes i en given fortynding (fx 1:10) 

eller indenfor et givet fortyndingsområde (fx 

1:10 - 1:40). Titreringen kan derfor med 

fordel tage udgangspunkt i producentens 

angivelser, men naturligvis omfatte både 

højere og - især - lavere koncentrationer af 

antistoffet. Da producentens angivelser oftest 

tager udgangspunkt i et “standard” visualiseringssystem, 

kan man, når man har optimereret 

sit system jfr. ovenstående regne 

med, at mange antistoffer skal benyttes i en 

fortynding, der er 5-50 x den oplyste! Når 

den primære titrering tager udgangspunkt i 

producentens anbefalinger, vil “dobbelt op” 

fortyndinger som oftest være tilstrækkelige 

(fx 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 etc.). Er der ingen 

anbefalinger fra producenten, er det nødvendigt 

at afsøge et større koncentrationsområde 

og derfor også have større afstand mellem de 

enkelte fortyndinger. I stedet for “dobbelt op” 

fortyndinger kan fortyndingstrin på gange 4 

anvendes (fx 1:10, 1:40, 1:160, 1:640 ect.).


I anden omgang kan “dobbelt op” fortyndinger 

så anvendes omkring den fortynding, der 

i første omgang gav de bedste resultater. 

Den optimale titer for pAbs ligger normalt 

mellem 1:100 og 1:10.000. mAbs, der leveres 

som supernatantantistoffer, har oftest en 

titer på mellem 1:5 og 1:200, mens mAbs i 

form af ascitesvæske kan have en optimal 

titer på op til 1:1.000.000. “Rå” ascites-Abs 

er sjældent kommercielt tilgængelige, idet de 

normalt altid fra producentens side vil være 

fortyndet til en titer, der svarer til supernatant-antistofferne. 

2.8.5 Fortyndervæske 

Den væske/buffer, der anvendes til at fortynde 

antistofferne, har ikke blot til formål at 

regulere koncentrationen af antistoffet under 

inkubationen. Fortyndervæsken bør vælges 

således, at den besidder flere andre kvaliteter. 

Fortyndervæsken skal således have et 

passende pH og saltindhold, så risikoen for, 

at antistoffet adhærerer uspecifikt til 

vævsproteiner, er minimal, samtidig med at 

antistof-antigen reaktionen ikke påvirkes 

negativt. Fortyndervæsken bør ligeledes indeholde 

et såkaldt carrierprotein, der skal 

beskytte antistofopløsninger med lavt proteinindhold 

mod antistofpolymerisation og antistofadsorbtion 

til overfladen af reagensglas. 

Tilsætning af 1% BSA vil have denne beskyttende 

effekt på antistofopløsninger. Samtidig 

virker BSA som ”blocking protein” og vil 

dermed nedsætte risikoen for uspecifik antistofadhæsion 

via hydrofob interaktion. En 

god universal fortyndervæske er derfor buffer 

a (Tabel 2.3). Den har i mange år været den 

foretrukne buffer til fortynding af både mAbs 

of pAbs. Nyere undersøgelser tyder dog på at 

buffere med neutralt pH som buffer a ikke 

nødvendigvis giver de bedste betingelser for 

mAbs. Boenisch (84,85) fandt i forsøg med 

14 forskellige mAbs, at de fleste - på HIERbehandlede 

paraffinsnit - gav de kraftigste 

reaktioner i Tris buffer ved pH 6,0 mens et 

enkelt (klon BLA.36, B-celle markør) gav de 

bedste resultater i Tris buffer ved pH 8,6. 

Boenisch fandt ligeledes at tilsætningen af 

0,15M NaCl svækkede reaktiviteten af en del 

af de testede mAbs. 

Konklusionen, Boenisch drog af sine arbejder, 

var bl.a. 

1. At PBS ikke bør anvendes som fortynderbuffer 

til mAbs. 

2. At buffer b ( 0,05M Tris pH 6,0) er mere 

velegnet som generel fortyndervæske til 

mAbs end buffer a. 

3. At optimeringen af brugen af et (nyt) mAb 

altid bør inkludere testning af minimum buffer 

a, b og c som fortynderbuffer. 

Forsøg i eget laboratorium har kun delvist 

kunne reproducere Boenischs fund. Vi finder 

(4) også at PBS generelt giver svagere reaktioner 

med en del mAbs, end TBS gør. 

Ligeledes ses pH og saltkoncentrationen i 

fortynderbuffer at påvirke immunreaktionerne, 

men hvor Boenisch kun noterer sig fordele 

ved manipulering af disse parametre, ser vi 

også væsentlig ulemper, der i mange tilfælde 

overskygger evt. fordele. Problemet med de 

radikale ændringer i pH og saltkoncentration 

som foreslået af Boenisch er, at langt de fleste 

antistoffer, vi har testet under disse forhold, 

giver tiltagende problemer med baggrundssværtning, 

hvilket vanskeliggør fortolkning 

af farvningsresultaterne. Årsagen til 

denne diskrepans er uklar. En del af forklaringen 

kan være, at Boenisch primært har 

benyttet sig af meget korte inkubationstider 

(10 min.), hvor vi har benyttet os af længere 

inkubationstider (60 min.). Ændringer i pH og 

saltkoncentration ændrer ladningsforholdene 

på såvel antistof som antigen. Målet er at 

genskabe det oprindelige forhold, hvor antigen 

og antistof oftest har modsat ladning. 

Herved vil elektrostatisk tiltrækning (ionbinding) 

i højere grad bidrage ved antistofantigen 

reaktionen. Elektrostatisk tiltrækning 

sikrer hurtigere binding af antistof til antigen, 

hvilket specielt ses tydeligt ved korte inkubationstider, 

omvendt vil uspecifik elektrostatisk 

tiltrækning til modsat ladede proteiner generelt 

favoriseres ved en forlænget inkubationstid. 

Bedre resultater er i rutinediagnostisk praksis 

opnået ved anvendelse af buffer f (4,89), 

hvor saltkoncentrationen i forhold til buffer a 

er halveret. Dette giver for mange mAbs lidt 

kraftigere reaktioner (mAbs kan ofte fortyndes 

lidt ekstra) uden problemer med baggrundssværtning. 

Buffer d og e er alternativer, der med fordel 

kan tages i anvendelse, hvis der arbejdes 

med Abs, der giver specielt mange problemer 

med uspecifik baggrundsfarvning. Bemærk, 

at Na-azid hæmmer peroxidase og derfor ikke 

må være tilstede i for høje koncentrationer i 

visualiseringens sidste lag. 

2.8.6 Opbevaring og holdbarhed af 

antistoffer 

De fleste antistofproducenter anbefaler at 

opbevare antistoffer ved 4°C eller -20°C. Da 

antistofopløsninger ikke tåler gentagende 

cykler af nedfrysning og optøning deles antistoffer, 

der skal opbevares ved -20°C i små 

portioner i fx eppendorf-rør. Holdbarheden af 

koncentrerede antistofopløsninger er generelt 

god. Opbevaret under de anbefalede betingelser 

er antistofferne holdbare i årevis. Specielt 

vil opbevaring ved -20°C eller ved -80°C 

betyde, at antistofferne kun taber minimalt i 

aktivitet over en lang årrække. Antistofkonjugater 

og fortyndede antistofopløsninger bør 

generelt opbevares ved 4°C. De fleste fortyndede 

antistoffer vil ved denne temperatur 

have en holdbarhed på adskillige måneder, 

forudsat at en passende bufferopløsning inkluderende 

15 mM Na-azid er anvendt til 

Mogens Vyberg 2005


fortyndingen (Tabel 2.3) I praksis betyder 

dette, at arbejdsopløsninger af mange antistoffer 

kan fremstilles i større mængder, fx 

hvad der svarer til 4-6 ugers forbrug. 

2.8.7 Kontrolprocedurer 

Den initiale afprøvning af et nyt antistof kan 

betragtes som en overordnet reagenskontrol. 

En kontrol, der i alle tilfælde er nødvendig 

for, at et givet antistof kan tages i anvendelse. 

Herefter kræver enhver immunhistokemisk 

analyse med det pågældende antistof en 

sideløbende kontrolprocedure, der kan vise, 

at et evt. negativt resultat skyldes fravær af 

antigen i det undersøgte præparat og ikke en 

fejl i analysen (falsk negativ reaktion). Kontrolproceduren 

skal ligeledes kunne vise, at 

et evt. positivt analyseresultat skyldes et 

reelt indhold af antigen og ikke krydsreagerende 

substanser, endogen enzymaktivitet, 

endogen biotin eller lignende (falsk 

positiv reaktion). En tilfredsstillende grad af 

kontrol på disse forhold opnås gennem: 

1. kontrolsnit med kendt positivt/negativt 

reaktionsmønster inkluderet i analysen 

2. substitution af det primære antistof på 

nabosnit med “non-immun” reagens. 

Ad 1) De bedste kontrolmuligheder opnås 

klart ved at anvende snit fra en multiblok. 

Multiblokken bør indeholde en række normalvæv 

og tumorvæv, der er præpareret som 

testpræparatet. Vævene til multiblokken bør 

endvidere vælges således, at antigenet forekommer 

i varierende koncentrationer. Inkluderes 

snit fra en “veldesignet” multiblok, vil 

det være muligt at vurdere antistoffets reaktionsmønster 

i den aktuelle analyse, samtidig 

med at sensitiviteten af analysen kan monitoreres. 

Kontrolsnit og testsnit monteres på 

samme glas! 

Ad 2) Der er flere muligheder for substitution 

af primært antistof: 

a. med primært antistof, der er absorberet 

med oprenset antigen 

b. med et andet irrelevant antistof 

c. med non-immun serum fra den samme 

dyre art hvori det primære antistof er rejst 

d. med fortynderbuffer. 

Den immunologisk mest korrekte substitutionskontrol 

er den første (a). Tilgængeligheden 

af (eller mangel på samme) og prisen på 

rene antigener gør dog denne form for kontrol 

urealistisk ved almindelige diagnostiske 

rutineundersøgelser. Den anden mulighed (b) 

for substitution er næsten altid tilstede ved 

diagnostiske undersøgelser, da der her traditionelt 

appliceres større eller mindre paneler 

af antistoffer rettet mod forskellige antigener. 

Substitution med fortynderbuffer (d) er simpel 

og altid mulig at udføre, og den gør det 

let at registrere 


reaktivitet, der kan tilskrives detektionssystemet 

og/eller kromogen/substratopløsningen 

(endogen enzymaktivitet, 

endogen biotin, krydsreaktivitet af sekundært 

antistof eller lignende). 

Vel vidende, at de beskrevne kontroller langt 

fra er fyldestgørende med hensyn til en præcis 

karakterisering af et antistofs specificitet 

(42), kan følgende kontrolforanstaltninger 

anbefales til sikring af den daglige kvalitet på 

de immunhistokemiske analyser: 

1. Der bruges kun primære antistoffer, der er 

procedureteknisk optimeret. Antistoffernes 

reaktivitet og specificitet skal være veldokomenteret 

og reproduceret i eget laboratorium. 

2. Snit monteres på glas med positive kontrolsnit 

(gerne fra multiblokke). 

3. Antistofundersøgelser bør altid laves som 

“panelundersøgelser”. 

4. Det primære antistof erstattes med fortynderbuffer 

på nabosnit til de snit, der 

skal immunfarves. Der skal medtages ét 

snit for hver demaskeringsprocedure. 

Vimentin kontrol 

På arkivmaterialer (paraffin), hvor kendskabet 

til fikseringstid og præparationsprotokolen 

i det hele taget er sparsomt, kan det være 

nyttigt at inkludere en såkaldt “vimentin 

kontrol” (43). 

Vimentin hører til de intermediære filamenter. 

Det findes i næsten alle mesenkymale 

celler. Påvisning af vimentin, der således 

findes stort set i alle væv, kan bruges til at 

vurdere graden af fikserings- og præparationsmæssige 

ændringer (maskering - evt. 

destruktion) af epitoper i et givet vævssnit. I 

praksis gøres dette ved at påvise vimentin 

ved hjælp af et mAb, klon V9, som detekterer 

en epitop på vimentin, der bl.a. er følsom 

overfor forlænget fikseringstid i formaldehyd. 

Det har vist sig, at mange epitoper på andre 

antigener viser fikserings- eller præparationsmæssigt 

betingede ændringer i antigenisiteten, 

der er analoge med ændringer i “V9 

epitopens” antigenisitet. Kvaliteten af farvningsresultaterne 

opnået med V9 kan derfor 

til en vis grad extrapoleres til andre antistoffer 

og dermed være til hjælp ved fortolkningen 

af farvningsresultaterne for disse. Betydningen 

af at inddrage en vimentin kontrol er 

dog aftaget i takt med udviklingen af HIER 

teknikken. Demaskeringsproblemet er forskelligt 

for de antistoffer, der kræver proteolytisk 

forbehandling og dem, der kræver varmeforbehandling. 

2.9 Skylleprocedure 

Før applikation af detektionssystem skylles 

(“vaskes”) grundigt i buffer med henblik på at 

fjerne overskydende antistof.


Figur 2.8: Signaturforklaring til Fig. 2.9-2.15 

2.9.1 Skyllebuffer 

TBS og PBS er de foretrukne skyllebuffere. 

Der er ikke beskrevet væsentlige kvalitative 

forskelle på disse to, men egne erfaringer 

(Aalborg) peger på TBS som den bedste. PBS 

bør undgås ved AP-baserede detektionssystemer, 

da phosphationer virker hæmmende 

på alkalisk phosphatase aktivitet. 

Azid-tilsætning til skyllebuffer og fortynderbuffer 

har været mistænkt for at hæmme 

peroxidaseaktivitet. Tilsætning af detergent 

til skyllebuffer anbefales af flere. På paraffinsnit 

vil tilsætning af Triton X-100 eller Tween 

20 i op til 1% nedsætte risikoen for uspecifik 

antistofadhæsion, samtidig med at penetrationen 

af immunreagenserne forbedres. Tilsætning 

af detergent til skyllebuffer er obligatorisk 

for immunostainere. 

2.9.2 Skylletid 

De fleste immunhistokemiske farvningsprotokoller 

opererer med skylletider mellem antistofinkubationerne 

på ialt 5 til 20 min. Meget 

tyder på, at selv ialt 5 min.’s skyl i flere hold 

Figur 2.9: Direkte teknik. 

buffer er mere end tilstrækkelige til at undgå 

problemer med baggrundsfarvning. Brigati et 

al. (7) fandt, at 3 gange 30 sek. skyl med 

detergentholdig buffer er tilstrækkelig til at 

undgå misfarvning af glas og væv ved immunfarvning 

efter “kapillærkræfternes princip”, 

der anvendes i de automatiske immunostainer 

som TechMate og CodeOn. Det skal 

dog bemærkes, at skylletider på under 5 min. 

efter inkubation med polymerkonjugater bør 

undgås, da der er risiko for, dette vil efterlade 

overskydende konjugat i prøvematerialet. 

Da antigen-antistof bindingen er reversibel, 

bør ukritisk forlængelse af skylleproceduren 

(timer) undgås, specielt vis antistoffer med 

lav affinitet anvendes. Forsøg med forlængelse 

af skylleproceduren til 16 timer har vist en 

tydelig svækkelse af farvningsintensiteten i 

forhold til det normale 5 min. skyl (4). 

2.10 Detektionssystemer 

Teknikker til detektion at antigenbundet antistof 

kan principielt inddeles i de direkte og de 

indirekte teknikker. Teknikkerne er illustreret 

i Figg. 2.9 - 2.15. Signaturforklaring til disse 

er givet i Fig. 2.8. 

2.10.1 Direkte teknikker 

I de direkte teknikker (Fig. 2.9) er det primære 

antistof direkte konjugeret til label 

(enzym eller fluorokrom). Detektion af antigenet 

kan derfor foregå via et enkelt step. 

Den type teknikker er simple og hurtige at 

udføre, men ikke særlig sensitive. Traditionelle 

direkte immunenzymatiske teknikker bruges 

stort set ikke længere. Direkte immunfluorescensteknikker 

bruges til gengæld stadig i 

et vist omfang ved påvisning af immunglobulinaflejringer 

ved glomerulonefritis og 

bulløse hudlidelser. Den direkte immunflourescensteknik 

er også indenfor immun-dobbeltfarvning 

meget anvendt, specielt i 

studier af co-lokalisation af to eller flere antigener 

i samme celle. 

Direkte polymerforstærkningsteknik 

Den direkte immunenzymatiske teknik har for 

nylig fået en renæssance gennem den såkaldte 

polymerforstærkningsteknik lanceret af 

DakoCytomation under navnet EPOS (Enhanced 

Polymer Onestep Staining) (Fig. 2.10). 

Systemet søger at løse de direkte teknikkers 

ringe sensitivitet gennem kobling af et større 

antal antistofmolekyler og peroxidase- eller 

phospatasemolekyler til den samme fleksible 

polymerforbindelse (dextran). Uden helt at nå 

de følsomme multistep-detektionssystemers 

sensitivitet har EPOS-teknikken bragt den 

direkte immunenzymatiske teknik tilbage som 

et alternativ indenfor specielle applikationer. 

EPOS kan således på frysesnit i en 10 min’s 

teknik bruges til at skelne lymfomer (CD45+) 

fra carcinomer (CK+) (41). 

Mogens Vyberg 2005


Figur 2.10: Enhanced Polymer One-step Staining 

(EPOS). 

På baggrund af deres egen polymerteknologi 

har firmaet Zymed ligeledes udviklet en direkte 

teknik. Zymed anvender polypeptider 

som ”backbone” i deres polymer. P.t. har 

firmaet kun et produkt byggende på denne 

teknologi: ”Sentinel Lymph Node Rapid IHC 

Kit”, hvormed det er muligt at detektere cytokeratin 

i cryosnit på under 10 min. Se også 

nedenfor om indirekte polymerforstærkningsteknik. 

2.10.2 Indirekte teknikker 

Antallet af forskellige indirekte detektionssystemer 

er meget stort. 

Den drivende kraft for udviklingen af de 

mange modifikationer har været ønsket om 

at kombinere den specifikke detektion af antigenbundet 

primært antistof med en så stor 

amplifikation (forstærkning) af signalet som 

muligt. I dag findes således mange kommercielt 

tilgængelige, robuste og meget sensitive 

detektionsystemer. De vigtigste systemer er: 

a. 2- og 3-lags teknikker 

b. Peroxidase anti-peroxidase (PAP) og Alkalisk 

phosphatase anti-alkalisk phosphatase 

(APAAP). 

c. Avidin-biotin systemer 

d. Polymerforstærkningsteknik. 

e. Tyramid Signal Amplifikation (TSA). 

Figur 2.11: Tolagsteknik (A) og trelagsteknik (B) 


Figur 2.12: APAAP-teknik (A) og PAP-teknik (B). 

2- og 3-lags teknikker 

2-lags teknikken (Fig. 2.11) er det simpleste 

indirekte detektionssystem. I denne teknik 

inkubers først med umærket primært antistof, 

fulgt af sekundært antistof rettet mod 

immunglobulin fra den dyreart, hvorfra det 

primære antistof stammer (fx mus). Det sekundære 

antistof er konjugeret med den ønskede 

label: horse radish [=peberrod] peroxidase 

(HRP), alkalisk phosphatase (AP) eller 

lignende. En fordel ved dette system er, at 

det enzymkonjugerede sekundære antistof 

kan anvendes til detektion af alle primære 

antistoffer, der er produceret i den pågældende 

dyreart (mus). Da der til hvert primære 

antistofmolekyle vil kunne bindes flere 

sekundære antistofmolekyler, er dette system 

væsentlig mere sensitivt end det direkte 

system. Sensitiviteten kan yderligere forbedres, 

hvis der efter det sekundære antistof 

inkuberes med et tertiært antistof (3-lags 

teknik, se Fig. 2.11) rettet mod immunglobulin 

fra dyrearten, der leverer det sekundære 

antistof (fx ged eller kanin). 

Peroxidase anti-peroxidase (PAP) og 

alkalisk phosphatase anti-alkalisk 

phosphatase (APAAP) 

PAP og APAAP benytter sig begge af præformerede, 

opløselige immunkomplekser dannet 

udfra en blanding af enzym (HRP eller AP) og 

antistof rettet mod det pågældende enzym 

(Fig. 2.12). Det er vigtigt for begge teknikkerne, 

at antistoffet, der anvendes i immunkomplekset, 

er rejst i samme dyreart som det 

primære antistof, da det sekundære antistof 

(“link-antistof”) skal kunne binde de to sammen. 

Link-antistoffet skal nødvendigvis anvendes 

i overskud, således at det, efter binding 

til det primære antistof med den ene 

“Fab-arm”, har den anden “Fab-arm” fri til 

binding af antistoffet, der indgår i immunkomplekset. 

Protokol for APAAP med repeat 

1. Inkubation med primært museantistof. 

2. Skyl med TBS fra sprøjteflaske. 

3. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 

4. Inkubér med Rabbit anti-mouse Ig (DakoCytomation 

Z259) fortyndet 1:25 i 1% 

BSA/TBS med 15 mM Na-azid. Inkubationstid 

30 min.


Figur 2.13: ABC-teknik (A) og LSAB-teknik (B) 

5. Skyl med TBS fra sprøjteflaske. 


7. Inkubér med APAAP-compleks (DakoCytomation 

D651) fortyndet 1:50 i 1% BSA/TBS 

med 15 mM Na-azid. Inkubationstid 30 min. 

8. Skyl med TBS fra sprøjteflaske. 


10. Gentag step 4 til 9. Inkubationstider for 

antistofopløsningerne medsættes til 10 min. 

11. Fremkald AP-aktivitet med Fast Red TR, New 

Fuchsin eller BCIP-NBT. 

12. Skyl, kernefarvning, dækglas. 

Avidin-biotin systemer 

Disse systemer bygger på den høje affinitet, 

avidin og streptavidin har for det lille protein 

biotin (Fig. 2.13). (Stept-)avidin har 4 binding 

sites for biotin og binder molekylet med 

en styrke, der langt overgår den styrke, hvormed 

antigen og antistof bindes til hinanden. 

Avidin er et basisk glycoprotein, der findes i 

store mængder i æggehvide. Ved neutralt pH 

vil nativt avidin have en positiv ladning, der 

vil kunne tiltrækkes stærke negative ladninger 

i vævet. Der er ligeledes en risiko for, at 

oligosaccharidkæder i molekylet kan bindes 

til lectinlignende substanser i vævet. Disse 

forhold gør, at man i avidin-biotin systemer 

oftest benytter sig af kemisk modificeret avidin 

eller af streptavidin. Den kemiske modifikation 

af avidinet går ud på at regulere det 

isoelektriske punkt for molekylet til neutralområdet 

(pH 7), samtidig med at de fleste 

oligosaccharidkæder fraspaltes. Streptavidin 

besidder de samme kemiske egenskaber 

overfor biotin som avidin, men det savner 

indhold af oligosaccharidkæder, samtidig med 

at molekylet har et neutralt isoelektriske 

punkt. Disse egenskaber har gjort streptavidin 

til et populært alternativ til avidin i 

immunhistokemisk sammenhæng. Streptavidin 

udvindes af bakterien Streptomyces avidinii. 

Alle (strept)avidin-biotin teknikker bygger 

sædvanligvis på anvendelsen af biotinylerede 

sekundære antistoffer. Det lille biotin 

molekyle (vitamin H) konjugeres i stort antal 

let og skånsomt til antistofmolekyler. For at 

forbedre (strept)avidinets mulighed for at 

binde biotin, konjugeres dette via en såkaldt 

“spacer-arm” til antistofmolekylet. Specielt 2 

varianter af (strept)avidin-biotin teknikkerne 

har vundet stor udbredning. 

Labelled (strept)avidin biotin 

Labelled (strept)avidin biotin (LSAB/LAB) 

(44) er en meget populær teknik, i hvilken 

(strept)avidinet er direkte konjugeret med 

label (Fig. 2.13). Som label anvendes oftest 

HRP eller AP, men principielt kan alle typer 

labels anvendes. LSAB/LAB teknikkerne udmærker 

sig ved at være meget sensitive og 

forholdsvis billige og simple at udføre, hvorfor 

teknikken på mange laboratorier er den foretrukne 

til rutinediagnostik. Eneste væsentlige 

ulempe ved systemet er problemerne med 

endogen biotin i visse væv. Ligesom med 

APAAP-teknikken kan inkubationsproceduren 

repeteres. Dette kan være nyttigt, hvis et 

eller andet går galt i første runde med en 

svag eller falsk negativ reaktion til følge, eller 

hvis man generelt ønsker at forbedre sensitiviteten. 

Protokol LSAB-HRP. Universalmetode for primære 

antistoffer fra kanin og mus 

1. Inkubation med primært antistof (kanin eller 

mus) 

2. Skyl med TBS fra sprøjteflaske 


4. Inkubation med blanding af biotinyleret ged 

anti-kanin Ig (DakoCytomation E432) og 

biotinyleret ged anti-mus Ig (DakoCytomation 

E433) E432 og E433 kan anvendes i fortynding 

1:100 -> 1:200 Antistofferne fortyndes 

i 1% BSA/TBS med 15 mM Na-azid. 

Inkubationstid 30 min. 

5. Skyl med TBS fra sprøjteflaske 


7. Inkubation med HRP-conjugeret streptavidin 

(DakoCytomation P397) P397 fortyndes 

1:100 - 1:300 i TBS. Inkubationstid 30 min. 


9. Fremkald HRP med Diaminobenzidin eller 

Aminoethylcarbazol. 

10. Skyl, kernefarvning, dækglas. 

Avidin-Biotin-Complex teknikken (ABC) 

I ABC-teknikken (45) appliceres et kompleks 

bestående af (strept)avidin og en biotinyleret 

label (HRP eller AP), indeholdende frie bindingssteder 

for biotin (Fig. 2.13). Komplekset 

binder sig til biotinmolekyler på det sekundære 

antistof. Den præcise sammensætning og 

størrelse af komplekset kendes ikke. Hsu’s 

(45) originale teknik benytter sig af en molær 

ratio mellem avidin og biotin-HRP på 2:1, 

hvilket teoretisk giver et stort overskud af 

avidin i complekset. Ændringer i ratio påvirker 

metodens sensitivitet. Det meget sensitive 

kommercielle kit “Vector Elite ABC-Kit” 

anvender således en ratio på 1:1 (46). Elite 

ABC complekserne indeholder sandsynligvis 

flere labelmolekyler end det originale ABC- 

Mogens Vyberg 2005


kompleks. En lovende ny modifikation på 

ABCsystemet er den såkaldte “StreptAvidin/reverse 

molar ratio ABC” (SA/rABC) (46). 

Teknikken benytter sig af komplekser med en 

omvendt (reverse) avidin biotin-HRP ratio. I 

praksis betyder dette, at complekset har et 

stort overskud af label og bindingssteder for 

avidin. For at få optimalt udbytte af komplekset 

inkuberes efter det biotinylerede sekundære 

antistof med streptavidin (SA). Med 

SA/rABC er opnået en væsentlig forbedring af 

sensitiviteten i forhold til den traditionelle 

ABC teknik. I ELISA assays er registreret en 

3-folds sensitivitetsforbedring. Lignende forbedringer 

er tillige opnået på semi-tynde 

plastsnit (46). 

Animal research kit (ARK) systemet 

Hovedparten af de kommercielle mAbs 

stammer fra mus. Dette er af stor betydning 

for dyreekperimentelle studier på mus. Skal 

immunhistokemiske studier foregå på denne 

type materiale vil man derfor ofte være nødsaget 

til at bruge primære museantistoffer. 

Anvendelsen af museantistoffer på musevæv 

stiller specielle krav til detektionssystemet. 

Traditionelle indirekte teknikker, hvor sekundære 

antistoffer (biotinylerede, enzymkonjugerede 

eller lign.) rettet mod muse Ig 

indgår, kan i sagens natur ikke anvendes, da 

disse antistoffer binder sig lige effektivt til 

endogent muse Ig som til det primære museantistof. 

En løsning på dette problem kan 

være at benytte direkte teknikker eller hapten-mærkede 

primære antistoffer (f.eks. FITC 

eller biotin). Ulempen ved direkte teknikker 

er manglende følsomhed (med mindre EPOS 

anvendes), samt det faktum at kun ganske få 

primære antistoffer findes enzymkonjugerede. 

Langt flere primære antistoffer findes 

hapten-mærkede. Specielt FITC- og biotinmærkede 

antistoffer findes der en del af. Det 

er dog stadig sådan, at hovedparten af de 

primære antistoffer ikke kan findes i en hapten-mærket 

variant. Det er derfor nødvendigt 

selv at foretage biotinylering eller lign. Det er 

Fig 2.14: EnVision teknik 


dog ikke alle laboratorier, der råder over den 

nødvendige teknologi til på traditionel vis at 

biotinylere. Ydermere kræver den traditionelle 

biotinylering ofte mere primært antistof, 

end der måske er til rådighed. DakoCytomations 

ARK-system er derfor et fortrinligt alternativ. 

Systemet benytter sig af, hvad man 

kunne kalde, en immunologisk biotinylering. 

Biotinyleringen foregår i reagensglas ved at 

blande eget primært muse antistof med et 

overskud af biotinyleret Fab sekundært antistof 

(anti-mus Ig) fra ARK-kittet. Det sekundære 

biotinylerede anti-mus antistof binder 

sig til det primære antistof, som herved indirekte 

biotinyleres. Overskydende biotinyleret 

Fab sekundært antistof bindes efterfølgende 

ved at tilsætte muse serum Ig til opløsningen. 

Opløsningen er herefter klar til brug 

(inkubation). Denne biotinyleringens-metode 

stiller ikke store krav til mængden af primært 

antistof, men forudsætter kendskab til Igkoncentrationen 

af det primære antistof. ARK 

teknikken består således af følgende trin: 

1. Biotinylering af primært antistof. 

2. Biotinyleret primært antistof appliceres på 

snit eller celler. 

3. Detektion af primært antistof vha. Strept- 

Avidin-HRP, efterfulgt af DABfremkaldning. 

ARK systemet udemærker sig ved stort set at 

eliminere problemet med endogent Ig i muse 

væv. I sammenligning (4) med alternative 

systemer som HistoMouse fra Zymed og MOM 

fra Vector giver ARK systemet klart det bedste 

signal/støjforhold. 

Indirekte polymerforstærkningsteknik 

EnVision 

EnVision (Fig. 2.14) er en indirekte polymerforstærkningsteknik. 

Den er udviklet af DakoCytomation 

og bygger - som EPOS systemet 

- på en nyudviklet polymerteknologi. I 

EnVision-systemet anvendes en fleksibel polymer 

(dextran), hvortil HRP eller AP og ged 

anti-mus og/eller ged anti-kanin immunglobuliner 

er koblet. Efter inkubation med primære 

antistoffer fra mus eller kaniner kan 

den efterfølgende detektion og amplifikation 

opnås gennem inkubation med denne mærkede 

polymer. Systemet er derfor meget 

enkelt og brugervenligt at arbejde med. Systemet 

har angiveligt en sensitivitet, der ligger 

på linje med mange kommercielle LSAB- 

og ABC-kits (47). Et nyt EnVision system, En- 

Vision+ blev lanceret i 1998. Systemets reaktivitet 

er blevet forbedret i forhold til det oprindelige 

system bl.a. gennem anvendelse af 

en blanding af dextran polymerer med forskellig 

molekylvægt. EnVision+ systemet er 

sammenlignet med en lang række detektionssystemer 

og fundet mere følsom end de 

fleste (64,65). Ofte kan de primære antistoffer 

fortyndes 2-4 gange mere ved anvendelse 

af EnVision+ sammenlignet med et traditio-


nelt non-kit LSAB system (64). I sammenligning 

med Vectors meget følsomme Elite ABC 

Kit er der med få undtagelser opnået identiske 

resultater hvad angår følsomhed (64). 

EnVision+ systemets store fordel er, at det 

udover at eliminere problemerne med endogen 

biotin også kombinerer høj følsomhed 

med nedsat assay-tid og reduceret håndtering. 

Den eneste væsentlige ulempe ved 

EnVision+ systemet synes at være prisen. På 

trods af den, i forhold til non-kit LSAB og Elite 

ABC, høje pris er systemet de senere år med 

rette blevet et meget populært detektionssystem 

inden for immunhistokemien. Erfaringer 

i eget laboratorium har kun været positive, 

med én undtagelse. EnVision+ systemet 

har givet problemer indenfor muskelpatologien. 

Immunhistokemien anvendes på muskelbiopsier 

i høj grad til at påvise normal eller 

aberrerende forekomst af en lang række muskelmembran 

relaterede antigener 

(dystrophiner, sarcoglycaner, lamininer mv.). 

Disse undersøgelser kan foretages både på 

cryosnit og paraffinsnit. Forsøg med 18 forskellige 

muskelmembran relaterede antigener 

viste, at EnVision+ på cryosnit i alle 18 tilfælde 

gav markant svagere reaktion i sammenligning 

med eget non-kit LSAB system. Dette 

var tilfældet uanset om snittene var ufikserede 

eller fikserede i acetone. På paraffinsnit af 

NBF fikseret muskel sås ligeledes de kraftigste 

reaktioner med LSAB systemet, men forskellen 

var generelt mere beskeden. Årsagen 

til dette fænomen skal sikkert søges i det 

faktum, at EnVision molekylerne er ganske 

store og muskelmembraner er meget tætte 

strukturer. Som konsekvens af den forholdsvis 

ringe følsomhed på muskelsnit, er EnVision+ 

på dette område erstattet med Power- 

Vision+ (se nedenfor). 

Kämermerer et al. beskrev i 2001 (83) en 

speciel haste-variant af Envision+, der kan 

anvendes peroperativt på cryosnit. Den samlede 

farvetid for metoden er ca. 15 min. I 

modsætning til haste-metoder baseret på 

EPOS metoden er det her muligt at anvende 

alle primære kanin og muse antistoffer. Gennem 

brug af primære antistoffer i højere koncentrationer 

end normalt (2-10 x højere koncentrationer) 

og en generel inkubationstemperatur 

på 37°C lykkes det at opnå forbavsende 

høj følsomhed. Følsomheden er 

naturligvis lavere end hvis traditionel EnVision+ 

protokol anvendes, men ikke voldsomt 

meget. I den originale protokol anvendes 

acetone fiksering i 1 min. efterfulgt af en kort 

tørring af snittene. 

En modificeret fikseringsprotokol (4, 92) har 

givet forbedret morfologisk og cytologisk 

bevarelse af såvel traditionelle cryosnit som 

CryoJane snit (se afsnit 2.4.1), samtidig med 

at problemer med endogen peroxidaseaktivitet 

stort set er elimineret. Denne fikseringsprotokol 

benytter en kombination af fiksering 

i 4 % NBF i 2 min. efterfulgt af demaskering i 

TEG/TE-buffer ved 95° C i 30 sek. Den forbedrede 

morfologiske og cytologiske bevarelse 

af cryosnittene har specielt været 

tydelig på lymfatisk materiale (Sentinel Node 

mv.). Mange antistoffer synes at give kraftigere 

reaktioner efter denne kombinationsfiksering 

end efter acetone fiksering alene. På 

traditionelle cryosnit af meget kollagenrige 

væv som hud og mamma kan der desværre 

være en risiko for tab af snit. På CryoJane 

snit ses dette problem ikke, da vedhæftningen 

af snittene her er meget stærkere. For 

laboratorier, der ikke har CryoJane teknologien 

til rådighed, kan det således være nødvendigt 

– på nogle væv - at sænke temperaturen 

i TEG/TE-bufferen til 60° C. Herved 

bevares alle væv, men man får desværre ikke 

hæmmet den endogene peroxidaseaktivitet. 

Protokol EnVision+ 


mus). Inkubationtid 30-60 min. 



4. Inkubation med peroxidasemærket ”Ready-to-use” 

EnVision+ polymer. Til primære 

kanin antistoffer anvendes DakoCytomation 

K4003. Til muse antistoffer anvendes DakoCytomation 

K4001. Inkubationstid 30 min. 



7. Fremkald HRP med Diaminobenzidin eller Aminoethylcarbazol. 


Protokol Haste-EnVision+ 

1. Cryosnit skæres og monteres på SuperFrost 

Plus glas. Snit tørres minimum 60 sek. 

2. NBF 4% 2 min. 

3. Skyl i TBS 10 sek. 

4. TEG-buffer ved 95°C 30 sek. 


6. Primært antistof ved 37°C 3 min. 


8. EnVision+ (DakoCytomation K4001 eller 

K4003) ved 37°C 3 min. 


10. DAB+ (DakoCytomation K3468) ved 37°C 3 

min. 

11. Skyl i postevand 10 sek. 

12. Dest. vand 5 sek. 

13. Mayers Hæmatoxylin 15 sek. 

14. Skyl i postevand ved ca. 42°C 30 sek. 

15. Dækglas monteres med Aquatex 

PowerVision/PowerVision+ 

Firmaet ImmunoVision Technologies bragte i 

1999 et nyt 2-lags detektionssystem på markedet 

ved navn PowerVision. PowerVision 

tilhører som EnVision og EPOS polymerforstærkningsteknikkerne. 

Hvor polymeren i 

EnVision er forholdsvis store dextran molekyler, 

benytter man sig i PowerVision af små 

såkaldte ”multifunktionelle polymeriserbare 

molekyler”, muligvis acrylsyre, biacrylsyre eller 

disses derivater, til at skabe nogle mere 

Mogens Vyberg 2005


Fig 2.15: PowerVision teknik 

kompakte polymerer, hvori der indgår enzymmolekyler 

(HRP) og link-antistofmolekyler 

i en passende ratio (mange enzymmolekyler 

pr. link-antistof) (Fig 2.15). 

I teorien skulle disse meget kompakte polymerer 

eliminere de steriske og penetrationsmæssige 

problemer, som polymerforstærkningssystemerne 

ellers kan være forbundet 

med (78). 

Shi et al testede systemet og sammenlignede 

det med 3 kommercielle avidin-biotin baserede 

3-lags metoder (men ikke med EnVision!) 

(78). PowerVision viste sig at være meget 

mere følsom (faktor 4-8 med hensyn til fortynding 

af primære antistof) end de øvrige 

systemer. I direkte sammenligning med EnVision+ 

synes PowerVision en smule mere følsom 

i detektionen af kerneantigener, mens 

EnVision+ er en smule mere effektiv i detektionen 

af membran- og cytoplasmatiske antigener 

(4). I 2002 blev en forbedret udgave af 

systemet lanceret, det såkaldte PowerVision+ 

kit (Fig. 2.16). I plus-versionen er sensitiviteten 

væsentlig forbedret for detektionen af 

primære museantistoffer. Den forbedrede 

sensitivitet opnås gennem inkubation med en 

såkaldt ”Post Antibody Block”, der i praksis er 

et sekundært link antistof (kanin anti-mus 

Ig). Inkubationstiden i ”Post Antibody Block” 

er 20 min. PowerVision+ må derfor nu betragtes 

som en 3-lags polymerforstærkningsteknik. 

I sammenligning med 2-lags polymerforstærkningsteknikkerne 

EnVision+ (Dako- 

Cytomation), MACH2 (BioCare) og Picture 

(Zymed). giver PowerVision+ med alle testede 

mAbs klart de kraftigste reaktioner. I forhold 

til EnVision+ giver PowerVision+ en sensitivitetsforbedring, 

der målt på fortynding af 

primært antistof ligger på en faktor 2-8 

(4,90). Et lignende 3-lags polymer system 

blev lanceret af BioGenex i 2003. Dette system 

går under betegnelsen: ”Super Sensitive 

Non-Biotin HRP Detektion System” og er 

hvad angår følsomhed på højde med Power- 

Vision+ (4). 


Fig 2.16: PowerVision+ teknik 

En general ulempe ved alle 3-lags polymerteknikkerne 

er naturligvis den forlængede 

analysetid på ca. 25 min. i forhold til 2-lags 

teknikkerne. 

Protokol PowerVision+ 


mus) Inkubationtid 30-60 min. 



4. Inkubation med ”Post-antibody Blocking”. 

inkubationstid 20 min. 



7. Inkubation med Poly-HRP anti-Mus/Kanin 

IgG Inkubationstid 30 min. 






Figur 2.17: Tyramid signal amplifikations-teknik.


Advance 

“Advance” er DakoCytomations svar på konkurrenternes 

meget følsomme 3-lags polymer 

systemer. Advance er en 3-lags teknik byggende 

på DakoCytomations egen dextran 

teknologi. Advance matcher de øvrige 3-lags 

polymer teknikker, hvad angår sensitivitet 

ved anvendelse af mAbs (4), men er mere 

følsom ved anvendelse af pAbs. 

Tyramid signal amplifikation 

Tyramid signal amplifikation (TSA) (Fig. 2.17) 

er i sig selv ikke et egentligt detektionssystem, 

men derimod et uhyre effektiv metode 

til at forstærke alle HRP-baserede detektionssystemer. 

Metoden er første gang beskrevet 

af Bobrow et al. i 1989 (48) til solid-phase 

immunoassays. Bobrow kaldte sin 

originale metode for “catalyzed reporter deposition” 

(CARD). Siden har modifikationer af 

metoden fået mange forskellige betegnelser. 

Blandt disse er TSA, som i dag nok er den 

mest anvendte. Adams (54) modificerede i 

1992 den oprindelige metode med henblik på 

brug ved immunhistokemiske teknikker. Teknikken 

benytter sig af HRP’s evne til oxidativ 

kondensering, herunder specielt dimerisering, 

af phenolforbindelser gennem en fri radikal 

mekanisme. 

Efter en traditionel peroxidaseteknik (fx 

LSAB) inkuberes med biotinyleret tyramid 

(phenolforbindelse) og brintperoxid. HRP i det 

vævsbundne immunkompleks katalyserer 

aktiveringen af tyramidet (til et fri radikal). 

Passende fortynding af det biotinylerede tyramid 

gør, at det frie radikal mellemprodukt 

vil bindes til elektronrige aminosyreradikaler 

(tyrosin, tryptophan, phenylanalin mv.) fremfor 

at dimerisere. Da det frie radikal er uhyre 

reaktivt, vil reaktionen foregå i umiddelbar 

nærhed af katalysatoren HRP. Man opnår 

med andre ord, at store mængder biotin - via 

tyramidet – bindes covalent til vævsproteiner 

i nærheden af det antigen, der undersøges. 

Biotinet kan herefter påvises på normal vis 

ved hjælp af fx HRP-konjugeret streptavidin. 

Alt i alt forlænges den samlede farvetid med 

ca. 45 min. ved at anvende TSA teknikken, til 

gengæld forbedres sensitiviteten dramatisk. 

Merz et al. (49) beskriver, at sensitiviteten 

forbedres så voldsomt, at primære antistoffer 

kan fortyndes 500-1000 gange mere og stadig 

give identiske resultater sammenlignet 

med en standard ABC-teknik. Nyere undersøgelser 

(4,66,67) bekræfter metodens kolossale 

følsomhed, omend 500-1000 folds fortyndinger 

af primære antistoffer hører til 

sjældenhederne. Mere end 100 antistoffer er 

blevet afprøvet, de fleste kan fortyndes 5 til 

50 gange yderligere i TSA-systemet og stadig 

give identiske eller bedre resultater end standardteknikker 

som LSAB og ABC. Tillige er en 

række antistoffer, der ikke tidligere er beskrevet 

til paraffinsnit, med TSAteknikken 

fundet brugbare (fx anti-CD6, klon ST23; anti-CD7, 

klon IOT7; anti-CD9, klon P-1/33; 

anti-CD11a, klon MHM24; anti-CD16, klon 

DJ130; anti-CD22, klon 4KB128; anti-CD23, 

klon MHM6; anti-CD33, klon WM54; anti-CD68, 

klon T-1/82a; anti-E-cadherin, klon 

36). 

Der er set en ganske stor variation i effekten 

af forstærkningen for de forskellige antistoffer 

(67) Anti-EBV-LMP, klon C1-4 kan således 

fortyndes 500 gange ekstra i TSA-systemet, 

mens anti-CD41, klon 5B12 kun kan fortyndes 

2,5 gange. Årsagen til de store forskelle 

hænger muligvis sammen med forskelle i det 

kemiske “mikromiljø”, der omgiver de enkelte 

epitoper (67). Bindingen af aktiveret tyramid 

til vævet kræver forekomst af elektronrige 

substanser som bl.a. tyrosin- og tryptophan- 

-aminosyreradikaler. Variationer i forekomsten 

af disse substanser formodes at påvirke 

effektiviteten af tyramid amplifikationen. 

TSA-teknologien udnyttes af 2 kommercielle 

kits. Catalyzed Signal Amplifikation (CSA) fra 

DakoCytomation og TSA fra NEN Life Science. 

Begge kit er relativt dyre. I forhold til non-kit 

LSAB skal beregnes 8-10 kr ekstra pr. glas. 

En væsentlig billigere løsning er at biotinylere 

tyramidet selv. Følges Adams’ (54) simple 

anvisninger, kan der for ca. 1500 kr fremstilles 

biotinyleret tyramid nok til ca. 10.000 

snit! 

NEN Life Science producerer foruden biotinyleret 

tyramid også en række fluorochromkonjugerede 

tyramid varianter. Med anvendelse 

af henholdvis fluorescein-, tetramethylrhodamine-, 

coumarin-, eller cyanin3-konjugeret 

tyramid istedet for biotinyleret tyramid kan 

opnås meget intens fluororescens. Fluororescens-TSA 

er langt mere følsom end fx en 

LSAB baseret fluororescensteknik. Primære 

antistoffer vil kunne fortyndes 5-20 gange 

mere. 

TSA protokol 

NEN’s TSA-Indirect-kit i kombination med et 

velfungerende non-kit LSAB system, danner 

basis for nedenstående protokol for paraffinsnit. 

Afparaffinering, hydrering og epitop 

demaskering foretages som sædvanlig, hvorefter 

metoden er: 

1. Blokering af endogen biotin med DakoCytomation 

Kit X0590 

2. Skyl med 0,05% Tween20 i TBS (TBST) 3 

hold i alt 6 min. 

3. Inkubation med 0,5% Blocking Reagent i 

TBS (TNB-buffer) 25 min. 

4. Inkubation med primært antistof fortyndet i 

TNB-buffer. 

5. Skyl med TBST fra sprøjteflaske 

6. Skyl i 3 hold TBST i alt 9 min. 

7. Inkubation med biotinyleret sekundært antistof. 

Til primære kanin antistoffer anvendes 

biotinyleret ged anti-kanin Ig (DakoCytomation 

E432) og til primære muse antistoffer 

biotinyleret ged anti-mus Ig (DakoCytomation 

E433). Begge antistoffer fortyndes 

1:200 i TNB-buffer. Inkubationstid 30 min. 



Mogens Vyberg 2005


10. Blokering af endogen peroxidaseaktivitet. 

Inkubation med ChemMate Peroxidase 

Blocking Solution (DakoCytomation S2023) 

10 min. 


12. Skyl i 3 hold TBST i alt 9 min. 

13. Inkubation med HRP-konjugeret streptavidin 





16. Inkubation med Biotinyleret Tyramid fortyndet 

1:50 i “Amplification Diluent”. Inkubationstid 

5-10 min. 



19. Inkubation med HRP-konjugeret streptavidin 





22. Skyl i TBS 2 min. 




Modifikation med hjemmelavet biotinyleret 

tyramid - efter Adams (54). 

40 ml boratbuffer, 50mM, pH 8,0 tilsættes under 

omrøring 100 mg Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce 

21335). Herefter tilsættes 31,2 mg Tyramine Hydrochlorid 

(Sigma T2879). Opløsningen omrørres 

natten over. Opløsningen bliver tiltagende mælket 

og viskøs. Næste dag filtreres opløsningen gennem 

0,45µm syringe filter. Opløsningen opbevares i 

Eppendorf- eller Nunc-rør ved -80°C. Før brug 

optøs stamopløsningen og fortyndes 1:100 (1:50 - 

1:200) i 50mM TBS, pH 8,0 indeholdende 0,0005 - 

0,001% brintperoxid. 

Blocking reagent fra NEN-kittet kan ligeledes 

erstattes uden konsekvens for kvaliteten. 

Casein (Sigma C-5890) er en fuldgod og billig 

erstatning. 

DakoCytomation Kit til blokering af endogen 

biotin kan erstattes af Miller’s (63) protokol, 

der er mindst ligeså effektiv. Med hensyn til 

blokering af endogen biotin er det dog værd 

at bemærke, at ingen af de 2 protokoller er i 

stand til at blokere den endogene biotin forekomst 

100% ved TSA teknikken. Der vil som 

regel restere en smule reaktion i de mest 

biotinrige væv som nyre, lever og binyre. 

Denne reaktion vil kun sjældent give fortolkningsmæssige 

problemer. Udelades blokeringen 

af endogen biotin vil mange normalvæv 

og tumorvæv til gengæld give en voldsom 

baggrundsfarvning, der vil vanskeliggøre 

identifikation og fortolkning af den specifikke 

immunreaktion. 


TSA-Plus 

Problemer med endogent biotin kan i TSA 

systemet nu helt undgås ved at anvende det 

såkaldte TSA Plus kit (NEN Life Science). 

Dette system baserer amplifikationen på 

DNP-tyramid og anti-DNP antistoffer. Systemet 

er således helt biotin-frit, hvorved blokering 

af endogent biotin helt kan undgås. Systemet 

er oprindeligt udviklet til In Situ Hybridisering, 

men kan med fordel anvendes til 

IHC, hvor det ifølge fabrikanten leverer en 

højere sensitivitet end den traditionelle TSA 

teknik. Et lignende biotin-frit system fås hos 

DakoCytomation under navnet CSA-II. Tyramidet 

er her mærket med FITC. DakoCytomation 

anbefaler CSA-II til immunhistokemi 

med mAbs. 

2.11 Kromogen/substratopløsning 

2.11.1 Horse radish peroxidase 

Indenfor immunhistokemien er horse radish 

peroxidase (HRP, horse radish = peberrod) 

den foretrukne enzymlabel. HRP er i sig selv 

usynlig, men kan visualiseres gennem flere 

simple histokemiske teknikker anvendende 

brintperoxid som substrat og adskellige forskellige 

kromogener. Blandt kromogenerne 

skiller 3-Amino-9Ethyl-Carbazol (AEC) og 

3,3’-Diaminobenzidin (DAB) sig klart ud som 

de foretrukne. 

Protokoller til visualisering af horse radish 

peroxidase (HRP) aktivitet 

a. AEC protokol: 

AEC 0,8% i acetone 10 ml 

Acetatbuffer 0,05 M pH 5,0 200 ml 

30% H2O2 100 µl 

Opløsningen filtreres før brug. Inkubationstid: 20 

min. Opløsningen kan genbruges flere gange inden 

for 60 min. AEC stamopløsning (0,8% AEC i acetone) 

er holdbar minimum 1 mdr. ved stuetemperatur. 

b. DAB protokol: 

Diaminobenzidin 50 mg 

TBS 0,05M, pH 7,4 100 ml 

30% H2O2 

50 µl 

Opløsningen filtreres før brug. Inkubationstid: 

10 min. Opløsningen kan genbruges flere 

gange inden for 60 min. For at undgå gentagne 

afvejninger af DAB-pulver, der er under 

mistanke for at være carcinogent, kan man 

anvende DAB-tabletter (fx DakoCytomation 

S3000). Desværre er det en ret kostbar løsning. 

Langt billigere er det at købe 5 g (på 

forhånd afvejet) DAB og opløse det hele på 

én gang i 100 ml dest. vand. Herved fremkommer 

en x100 koncentreret stamopløsning, 

der opbevares ved - 20°C i passende 

små portioner (fx 1 ml). Stamopløsningen 

kan så efter optøning fortyndes 1:100 

i buffer og tilsættes brintperoxid (se også 

nedenfor om kommercielle kit til HRP påvisning).


AEC og DAB fungerer som elektrondonor i 

den enzymkatalyserede omsætning af brintperoxid. 

Begge oxideres til farvede tungtopløselige 

produkter. AEC giver et brillant rødbrunt 

reaktionsprodukt, der er opløseligt i 

alkohol. AEC-fremkaldte præparater kræver 

derfor montering med hydrofile monteringsmidler. 

Præparater fremkaldt med AEC bør 

opbevares mørkt, da stærk lyspåvirkning kan 

få reaktionsproduktet til at blege (“fade”) i 

intensitet. 

DAB giver et brunt reaktionsprodukt, der er 

uopløseligt i alkohol og andre organiske opløsningsmidler. 

Sensitiviteten af de 2 protokoller 

er i flere arbejder blevet sammenlignet. 

De Jong et al (50) fandt, at de 2 protokoller 

var lige sensitive. Scopsi og Larsson (51) 

fandt derimod, at DAB var en smule mere 

sensitiv end AEC. En væsentlig fordel ved 

DAB er dog, at sensitiviteten med forholdsvis 

enkle midler kan forbedres betydeligt. Blandt 

mange forskellige protokoller kan specielt 3 

meget simple og meget reproducerbare teknikker 

anbefales. 

Protokoller til forstærkede DAB reaktioner 

c. DAB/imidazol (0,1M) protokol: 

Imidazol 700 mg 

TBS, pH 7,4 100 ml 

pH justeres til 7,4 med 1N HCl 

Diaminobenzidin 50 ml 

30% H2O2 

35 µl 

Opløsningen filtreres før brug. Inkubationstid: 5-10 


for 60 min. 0,1M imidazol i TBS er holdbar 1 mdr. 

ved stuetemperatur. 

d. DAB-Nikkel protokol: 

Diaminobenzidin 50 mg 

Acetatbuffer 0,1M, pH 6,0 100 ml 

Nikkelsulfat 0,8 g 

30% H2O2 

35 µl 

DAB opløses først, dernæst nikkelsulfat. 

Opløsningen filtreres før brug. Inkubationstid: 10 


for 60 min. 

DAB/nikkel fremkaldning giver et intenst blåsort 

reaktionsprodukt, der er uopløseligt i 

alkohol og xylen. Den blåsorte farve gør, at 

DAB/nikkel protokollen med fordel kan anvendes 

i dobbeltfarvningsprotokoller. I den 

forbindelse er det dog vigtigt at bemærke, at 

reaktionsproduktet efter DAB/nikkel bleger 

meget hurtigt i præparater, der er monteret 

med hydrofile monteringsmidler som fx AquaTex 

og AquaMount. 

e. Kobbersulfat (0,5%) protokol: 

Kobbersulfat 0,5 g 

PBS, TBS eller fysiologisk saltvand 100 ml 

Efter fremkaldning med DAB eller DAB/imidazol 

protokol kan yderligere forstærkning 

opnås ved at inkubere 5-10 min. i 0,5% kobbersulfat. 

Det originale DAB reaktionsprodukt 

bliver herved mørkere og mere intens i farven. 

Specielt kombinationen af DAB/imidazol 

protokollen og kobbersulfat efterbehandling 

kan pga af sin enkelhed og forbedrede sensitivitet 

anbefales. Kobbersulfat kan genbruges 

flere dage. 

Kommercielle kits til HRP påvisning 

På det kommercielle marked findes mange 

udmærkede og brugervenlige 2-komponent 

og endog enkelte “Ready-to-use” 

1-komponent kits af både DAB og AEC. 

Blandt de kommercielle DAB kits skal fremhæves 

den fra KemEnTec (4170) og DakoCytomations 

DAB+ (K3468). Begge kits kan 

med fordel kombineres med efterbehandling i 

kobbersulfat. 

For AEC’s vedkommende synes det med kits 

muligt at opnå en vis sensitivitetsforbedring i 

forhold til en standard AEC protokol. DakoCytomation’s 

“Ready-to-use” AEC+ (K3469) 

giver således en sensitivitetsforbedring, der 

svarer til en fortyndingsfaktor på ca. 2 for de 

de primære antistoffer. Prisen på de fleste 

kits udelukker desværre muligheden for “immersions-inkubation” 

i farveskåle, inkubationen 

må i stedet foretages som en mere arbejdskrævende 

“dråbeinkubation” på hvert 

enkelt glas. 

NovaRed 

Firmaet Vector, der primært har specialiseret 

sig indenfor detektionssystemer og chromogen/substrat 

kits, lancerede i 1999 et nyt 

følsomt kit til HRP påvisning. Systemet hedder 

Vector NovaRed. NovaRed giver et rødbrunt 

reaktionsprodukt, lidt mørkere end 

AECs reaktionsprodukt. Snit fremkaldt med 

NovaRed kan dehydreres og monteres med 

hydrofobe monteringsmidler som PerTex, 

VectaMount eller lignende. Til gengæld er 

reaktionsproduktet ikke stabilt i det hydrofile 

monteringsmiddel, AquaTex. 

NovaRed matcher den kobbersulfat-forstærkede 

DAB/imidazol protokol, hvad 

angår følsomhed (4). NovaRed er derfor et 

glimrende tilbud til dem, der ønsker et 

HRP-chromogen i “AEC-farve” men med en 

følsomhed og monteringsegenskaber som de 

bedste DAB protokoller. I forhold til andre 

kommercielle kits er prisen rimelig. 1 ml arbejdsopløsning 

koster ca. 3 kr. DakoCytomations 

DAB+ (K3468) koster til sammenligning 

næsten det dobbelte! 

2.11.2 Alkalisk phosphatase 

Indenfor hæmatologien er alkalisk phosphatase 

(AP) et vigtigt alternativ til HRP som 

enzymlabel. Påvisning af AP-aktivitet kan 

Mogens Vyberg 2005


opnås gennem flere forskellige og velfungerende 

histokemiske teknikker. To principielt 

forskellige teknikker anvendes i de fleste 

tilfælde. 

Den ene teknik er den såkaldte simultankoblingsreaktion, 

hvor AP katalyserer fraspaltningen 

af phosphat fra en naphtholphosphatesterforbindelse. 

Efter fraspaltning kobler 

naphtholforbindelsen til diazoniumforbindelser 

(kromogen), der er tilsat substratopløsningen. 

Koblingsproduktet er farvet og tungtopløseligt 

i vandige medier. Specielt 2 simultan-koblingsreaktioner, 

der hver for sig benytter 

sig af forskellige kromogen-substrat 

kombinationer, kan på grund af deres sensitivitet 

og reproducerbarhed anbefales. Det 

drejer sig om Fast Red TR/Naphthol-AS-MX 

Phosphat (“Fast Red TR”) og New Fuchsin/Naphthol-AS-BI 

Phosphat (“New Fuchsin”). 

Den anden teknik til påvisning af AP er den 

såkaldte Indoxyl-Tetrazolium teknik, hvor AP 

katalyserer fraspaltningen af phosphat fra en 

indoxylphosphatester. Den frie indolyl-forbindelse 

er herefter i stand til at reducere 

tetrazoliumsalte, der herved udfældes i vævet 

som farvede og tungtopløselige formazaner. 

Til denne type teknikker hører Bromo-Chloro-Indoxyl-Phosphat/Nitro 

B Tetrazolium 

(BCIP-NBT) metoden (50) BCIP-NBT er 

en sensitiv metode, men på trods af dette 

ikke særlig udbredt inden for immunhistokemien. 

BCIP-NBT giver et intenst blåsort granulært 

reaktionsprodukt, der er stabilt i etanol 

og xylen. BCIP-NBT substratopløsningen 

udmærker sig ved at være mere stabil end 

Fast Red TR og New Fuchsin opløsningerne, 

hvilket gør det muligt at forlænge inkubationstiden 

betydeligt. I visse in situ hybridiserings-teknikker 

anvendes således inkubationstider 

på 16 timer i BCIP-NBT, hvilket giver 

en betydelig forbedring af sensitiviteten. Den 

meget lange inkubationstid er kun mulig i 

kraft af dels den gode holdbarhed af 

BCIP-NBT og dels af det faktum, at AP enzymet 

ikke inaktiveres så hurtigt som HRP under 

enzymreaktionen. 

Protokoller til visualisering af alkalisk 

phosphatase (AP) aktivitet 

a. Fast Red TR protokol: 

Naphthol AS-MX Phosphate Sigma 

No. N5000 10 ml 

Tris buffer 0,1 M pH 8,2 50 ml 

Levamisol 1 M 50 µl 

Fast Red TR salt Sigma No. F2768 50 mg 

Naphthol AS-MX opløses i Tris buffer. Opløsning er 

holdbar 14 dage ved 4°C. Lige før brug tilsættes 

Levamisol og Fast Red TR salt. I LSAB-AP teknikken 

nedsættes mængden af levamisol til 25µl (se 

afsn. 2.5.1). Når Fast Red TR er gået i opløsning 

filtreres. Inkubationstid: 20 - 60 min. Ønskes et 

blåt reaktionsprodukt erstattes Fast Red TR med 

Fast Blue BB (Sigma F3378). 


b. New Fuchsin protokol: 

Stamopløsning A: 

Naphthol AS-BI Phosphat Sigma 

No. N2250 25 mg 

N,N-Dimethylformamid Merck No. 3034 300 µl 

Stamopløsning B: 

Natriumnitrit 4%, frisk fremstillet 250 µl 

New Fuchsin 5% i 2 M HCl, Merck No. 4041 100 µl 

Tris buffer 0,05M, pH 8,7 50 ml 

Levamisol 1 M 50 µl 

New Fuchsin og natriumnitrit blandes under omrystning 

i 60 sek. Blandingen foregår i stinkskab, 

da der kan udvikles nitrøse dampe. Herefter tilsættes 

Tris buffer og til sidst Levamisol. I LSAB-AP 

teknikken nedsættes mængden af levamisol til 25µl 

(se afsn. 2.5.1). 

Arbejdsopløsning 

De frisk fremstillede stamopløsning blandes grundigt 

(opl. B i opl. A). Den færdige arbejdsopløsning 

filtreres før brug. Inkubationstid: 20-60 min. 

Fast Red TR og New Fuchsin protokollerne 

giver klare røde reaktionsprodukter, der er 

uopløselige i vandige medier. Fast Red TR 

reaktionsproduktet er ikke stabilt i organiske 

opløsningsmidler, hvorfor montering med 

hydrofile monteringsmidler er påkrævet. New 

Fuchsin reaktionsproduktet er angivet til at 

være stabilt i etanol og xylen (50), hvilket 

gør montering med hydrofobe monteringsmidler 

mulig. Egne undersøgelser har dog 

vist, at selv efter en hurtig dehydrering i etanol 

synes reaktionen svagere (og lysere i 

farvenuancen) i hydrofobt monterede præparater 

end i hydrofilt monterede præparater. 

Montering med hydrofilt monteringsmiddel 

synes derfor at være det sikreste - også for 

New Fuchsin fremkaldte præparater. 

Fast Red TR opløsningen er mere simpel at 

fremstille end New Fuchsin. Samtidig giver 

Fast Red reaktionsproduktet en intens orangerød 

fluorescens (53), der i fluorescensmikroskopet 

giver mulighed for en væsentlig 

mere sensitiv detektion af reaktionsproduktet, 

end den traditionelle lysmikroskopiske 

undersøgelse kan. En væsentlig ulempe ved 

Fast Red TR er, at reaktionsproduktet i acetone 

og NBF-fikserede frysesnit er meget 

granulært og med en udpræget tendens til 

diffusion ud fra den primære lokalisation af 

AP. Med New Fuchsin ses ikke de samme 

problemer på frysesnit. Reaktionsproduktet 

er mere amorft og homogent uden synlig 

tendens til diffusion. Lysmikroskopisk er New 

Fuchsin angivet til at være en smule mere 

sensitivt end Fast Red TR (50). På trods af 

dette må det anbefales, bl.a. på grund af den 

simple protokol og fluorokrom egenskaberne, 

at anvende Fast Red TR til cytologisk materiale 

og paraffinsnit. Til gengæld bør New 

Fuchsin rutinemæssigt anvendes på frysesnit. 

Kommercielle kits til AP-påvisning 

Udbudet af kits til AP-påvisning er stort. Hvad 

angår sensitivitet er der gode muligheder for 

at finde produkter, der giver en forbedret


sensitivitet i forhold til standardprotokollerne 

for Fast Red og New Fuchsin. En mindre, 

sammenlignende undersøgelse af 4 kommercielle 

kits og de 2 standardprotokoller viste, 

at alle 4 kits var mere følsomme end standardprotokollerne 

(4). Specielt gode resultater 

blev opnået med DakoCytomation’s Fast 

Red kit (K0597), DakoCytomation’s New 

Fuchsin kit (K0596) samt “Vector-Red” og 

“Vector Blue” fra Vector Laboratories. Alle 4 

kits gav en sensitivitetsforbedring svarende 

til en fortyndingsfaktor på de primære antistoffer 

på minimum 2. 

2.12 Kernefarvning 

For at kunne iagttage den præcise lokalisation 

af reaktionsproduktet i forhold til vævs- 

og cellemorfologien afsluttes den immunhistokemiske 

farvemetode sædvanligvis med 

en kernefarvning. Valg af kernefarvning afhænger 

af det anvendte kromogen. Farvning i 

Mayers Hæmatoxylin eller lignende vandige 

Hæmatoxylinopløsninger fungerer fint sammen 

med de fleste kromogener (Fast Red, 

New Fuchsin, AEC og DAB). En farvetid i 

Mayers hæmatoxylin på 2 min. er det almindelige, 

men ved påvisning af kernelokaliserede 

antigener kan farvetiden med fordel nedsættes 

til 30 sek. Mayers hæmatoxylin tåler 

montering med både hydrofile monteringsmidler 

(AquaMount, AquaTex, Glycergel o.l.) 

og hydrofobe midler (PerTex, DPX o.l.). 

Ethylgrøn (Methylgrøn) eller Neutralrød (50) 

kan med fordel anvendes, hvis BCIP-NBT 

bruges som kromogen. Ethylgrøn har ligeledes 

været anvendt i kombination med DAB 

og DAB-Nikkel. Det forudsætter blot, at der 

anvendes hydrofobe monteringsmidler, da 

Ethylgrøn ikke er særlig stabil i de hydrofile. 

Anvendes Ethylgrøn skal man yderligere være 

opmærksom på, at farvbarheden af cellekerner 

nedsættes efter HIER forbehandling (på 

grund af DNA denaturering). 

Azur B kan med fordel anvendes som kernefarvning 

i stærkt pigmenterede melanocytiske 

læsioner (55), hvor det kan være svært at 

skelne melanins egenfarve fra kromogener 

som AEC og specielt DAB. Azur B giver - foruden 

den blå kernefarvning - en intens grønblå 

farvning af melanin i melanofager, hvorved 

pigmentet let adskilles fra kromogenet. 

2.13 Referencer 

1. Kohler G, Milstein C. (1975). Continuous cultures of 

fused cells producing antibody of pre-difined specificity.Nature 

256: 495. 

2. Gatter KC, Falini B, Mason DY. (1984). The use of 

monoclonal antibodies in histopathological diagnosis. 

Recent Advances in Histopathology. Churchill Livingstone 

side 35-67. 

3 Lyon H. (1985). Histokemi I og II. DSR Forlag Landbohøjskolen 

KBH. 

4 Egne ikke publiserede data. 

5 Rasmussen BB, Hjort KN, Mellerup I, Sether G, Christensen 

N. (1992). Vegetable oils instead of xylene in 

tissue processing.APMIS 100: 827. 

6 Prioleau J, Schnitt SJ. (1995). p53 antigen loss in 

stored paraffin slides.The New England Journal Of 

Medicine 332: 1521. 

7 Brigati DJ, Budgeon LR, Unger ER, Koebler D, Cuomo 

C, Kennedy T, Permodo JM. (1988). Immunocytochemistry 

is automated: Development of a robotic 

workstation based upon the capillary action principle. 

The Journal of Histotechnology 11:165. 

8 Li C-Y, Ziesmer SC, Villareal OL. (1987). Use of azide 

and hydrogen peroxide as an Iinhibitor for endogenous 

in the immunoperoxidase method.The Journal of 

Histochemistry and Cytochemistry 35: 1457. 

9 Miller RT, Groothuis CL. (1990). Improved avidinbiotin 

immunoperoxidase method for terminal deoxyribonucleotidyl 

transferase and immunophenotypic 

characterization of blood cells.American Journal of 

Clinical Pathology 93: 670. 

10 Yam LT, Janckila AJ, Epremian BE, Li C-Y. (1989). 

Diagnostic significance of levamisol-resistant alkaline 

phosphatase in cytochemistry and immunocytochemistry. 

American Journal of Clinical Pathology 91: 31. 

11 Thisted K. (1995). The use of levamisol in immunohistochemistry. 

Pathology Research and Practice 191: 

797. 

12 Yokoyama S, Kashima K, Inoue S, Daa T, Nakayama 

I Moriuchi A. (1993). Biotin-containing intranuclear 

inclusions in endometrial glands during gestation and 

puerperium. American Journal of Clinical Pathology 

99: 13.. 

13 Huang S, Minassian H, More JD. (1976). Application 

of immunoflourescent staining in paraffin sections 

improved by trypsin digestion. Laboratory Investigation 

35: 383. 

14 Curran RC, Gregory J. (1977). The unmasking of 

antigens in paraffin sections of tissue by trypsin. Experientia 

33: 1400. 

15 Battifora H, Kopinski M. (1986). The influence of 

protease digestion and duration of fixation on the 

immunostaining of keratins. The Journal of Histochemistry 

and Cytochemistry 34: 1095. 

16 Fraenkel-Conrat H, Brandon BA, Olcott HS. (1947). 

The reaction of formaldehyde with proteins. IV. Participation 

of indole groups. Journal of Biological 

Chemistry 168: 99 

17 Fraenkel-Conrat H, Olcott HS. (1948). Reactions of 

formaldehyde with proteins. VI. Cross-linking of 

amino groups with phenol imidazol, or indole groups. 

Journal of Biological Chemistry 174: 827. 

18 Fraenkel-Conrat H, Olcott HS. (1948). The reaction of 

formaldehyde with proteins. V. Cross-linking between 

amino and primary amide or guanidyl groups. Journal 

of the American Chemical Society 70: 2673. 

19 Shi SR, Key ME, Kalra KL. (1991). Antigen retrieval 

in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: An enhancement 

method for immunohistochemical staining 

based on microwave oven heating of tissue sections. 

The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 39: 

741. 

20 Cattoretti G, Pileri S, Parravicini C, Becker MHG, 

Poggi S, Bifulco C, Key G, D’Amato L, Sabattini E, 

Feudale E, Reynolds F, Gerdes J, Rilke F. (1993). Antigen 

unmasking on formalin-fixed, paraffinembedded 

tissue sections. Journal of Pathology 171: 

83. 

21 Werner M, Wasielewski RV, Komminoth P. (1996). 

Antigen retrieval, signal amplification and intensification 

in immunohistochemistry. Histochemistry and 

Cell Biology 105: 253. 

22 Gown AM, Wever ND, Battifora H. (1993). Microwavebased 

antigenic unmasking. A revolutionary new 

technique for rutine immunohistochemistry. Applied 

Immunohistochemistry 1: 256. 

23 Leong ASY, Milios J. (1993). An assessment of the 

efficacy of the microwave antigen-retrieval procedure 

on a range of tissue antigens. Applied Immunohistochemistry 

1: 267. 

24 Bankfalvi A, Navabi H, Bier B, Böcker W, Jasani B, 

Schmid KW. (1994). Wet autoclave pretreatment for 

antigen retrieval in diagnostic immunohistochemistry. 

Journal of Pathology 174: 223. 

25 Norton AJ, Jordan S, Yeomans P. (1994). Brief, hightemperature 

heat denaturation (pressure cooking).: A 

simpel and effective method of antigen retrieval for 

Mogens Vyberg 2005


rutinely processed tissues. Journal of Pathology 173: 

371. 

26 Shi SR, Gu J, Kalra KL, Chen T, Cote RJ, Taylor CR. 

(1995). Antigen retrieval technique: A novel approach 

to immunohistochemistry on rutinely processed tissue 

sections. Cell Vision 2: 6. 

27 Shi SR, Imam SA, Young L, Cote RJ, Taylor CR. 

(1995). Antigen retrieval immunohistochemistry under 

the influence of pH using monoclonal antibodies. 

The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 43: 

193. 

28 Beckstead JH. (1994). Improved antigen retrieval in 

formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Applied 


29 Morgan JM, Navabi H, Schmid KW, Jasani B. (1994). 

Possible role of tissue-bound calcium ions in citratmediated 

high-temperature antigen retrieval. Journal 

of Pathology 174: 301. 

30 Reynolds GM, Young FI, Young JA, Williams A, Rowlands 

DC. (1994). Microwave oven antigen retrieval 

applied to the immunostaining of cytopathology 

specimens. Cytopathology 5: 345. 

31 Hølund B, Gundersen P, Holm K (1995). Can Ki67 

detection be used in selection between normal cells 

and carcinoma in situ in smears? 9th World Congress. 

Cervical Pathology & Colposcopy. Abstract 322. 

32 Tacha DE, McKinney L. (1992). Casein reduces nonspecific 

background staining in immunolabeling techniques. 

The Journal of Histotechnology 15: 127. 

33 Linscott www.linscottsdirectory.co.uk. 

34 MSRS www.antibodies-probes.com. 

35 Battifora H. (1986). The multitumor (sausage) tissue 

block: Novel method for immunohistochemical antibody 

testing. Laboratory Investigation 55: 244. 

36 Kraaz W, Risberg B, Hussein A. (1988). Multiblock: an 

aid in diagnostic immunohistochemistry. The Journal 

of Clinical Pathology 41: 1337. 

37 Miller RT, Groothuis CL. (1991). Multitumor “sausage” 

blocks in immunohistochemistry. Simplified method of 

preparation, practical uses, and roles in quality assurance. 

American Journal of Clinical Pathology 96: 

228. 

38 True LD. (1991). Parallel array method of embedding 

multiple tissue samples in a single paraffin block. The 

Journal of Histotechnology 14: 101. 

39 Stross WP, Jones M, Mason DY. (1989). Automation 

of APAAP immunocytochemical technique. The Journal 

of Clinical Pathology 42: 106. 

40 Pfeiffer P, Grabau DA, Nielsen O, Clausen PP. (1996). 

Immunohistochemical bulk staining of slides using a 

rack peroxidase-labelled streptavidin-biotin technique. 

Applied Immunohistochemistry 4: 135. 

41 Chilosi M, Lestani M, Pedron S, Montagna L, Benedetti 

A, Pizzolo G, Menestrina F. (1994). A rapid immunostaining 

method for frozen sections. Biotechnic and 

Histochemistry 69: 235. 

42 Larsson LI (1988). Immunocytochemistry: Theory 

and practice CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. 

43 Battifora H. (1991). Assesment of antigen damage in 

immunohistochemistry. The vimentin internal control. 

American Journal of Clinical Pathology 96: 669. 

44 Guesdon JL, Terynck T, Avrameas S. (1979). The use 

of avidib-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. 

The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 

27: 1131. 

45 Hsu SM, Raine L, Fanger H. (1981). Use of avidinbiotin-peroxidase 

complex (ABC). in immunoperoxidase 

techniques: a comparison between ABC and 

unlabeled antibody (PAP). procedures. The Journal of 


46 Isabella MG, Rüdiger WV, (1995). The SA/rABC technique: 

A new ABC procedure for detection of antigens 

at increased sensitivity. The Journal of Histochemistry 

and Cytochemistry 43: 31. 

47 DakoCytomation. 

48 Bobrow MN, Harris TD, Shaughnessy KJ, Litt GJ. 

(1989). Catalyzed reporter deposition, a novel 

method of signal amplification. Journal of Immunological 

Methods 125: 279. 

49 Merz H, Malisius R, MannWeiler S, Zhou R, Hartmann 

W, Orscheschek K, Moubayed P, Feller AC. (1995). 

Immunomax: A maximized immunohistochemical 


method for the retrieval and enhancement of hidden 

antigens. Laboratory Investigation 73: 149. 

50 De Jong ASH, Van Vark MVK, Raap AK. (1985). Sensitivity 

of various visualization methods for peroxidase 

and alkaline phosphatase activity in immunoenzyme 

histochemistry. Histochemical Journal 17: 

1119. 

51 Scopsi L, Larsson LI (1986). Increased sensitivity in 

peroxidase immunocytochemistry. A comparative 

study of a number of peroxidase visualizing methods 

employing a model system. Histochemistry 84:221. 

52 Boenish T (1989). Handbook. Immunochemical 

staining methods: s.23. 

53 Speel EJM, Schutte B, Wiegant J, Ramaekers FCS, 

Hopman AHN. (1992). A novel fluorescence detection 

method for In Situ Hybridization, based on the alkaline 

phosphatase-Fast Red reaction. The Journal of 


54 Adams JC. (1992). Biotin amplification of biotin and 

horseradish peroxidase signals in histochemical 

stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 

40: 1457. 

55 Sayadi H, Fitzgibbon JF, Swanson PE, Wick MR. 

(1995). Azure B as a counterstain in the immunohistological 

evaluation of heavily pigmented nevomelanocytic 

lesion. Applied Immunohistochemistry 3: 

268. 

56 Williams JH, Mepham BL, Wright DH. (1997). Tissue 

preparation for immunocytochemistry. The Journal of 

Clinical Pathology 50: 422. 

57 Arbner JM, Arbner DA, Jenkins KA, Battifora H. 

(1996). Effect of decalcification and fixation in paraffin-section 

immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry 

4: 241. 

58 Dash RC, Ballo MS, Layfield LJ. (1998). Decay of 

androgen receptor immunoreactivity in archived tissue 

by using monoclonal antibody F39.4.1. Applied 


59 Jacobs TW, Prioleau JE, Stillman IE, Schnitt SJ. 

(1996). Loss of tumor marker-immunostaining intensity 

on stored paraffin slides of breast cancer. Journal 

of the National Cancer Institute 88: 1054. 

60 Bertheau P, Cazals-Hatem D, Meignin V, de Roquancourt 

A, Vérola O, Lesourd A, Séné C, Brocheriou C, 

Janin A. (1998). Variability of immunohistochemical 

reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical 

Pathology 51: 370. 

61 Shin HJC, Kalapurakal SK, Lee JJ, Ro JY, Hong WK, 

Lee JS. (1997). Comparison of p53 immunoreactivity 

i fresh-cut versus stored slides with and without microwave 

heating. Modern Pathology 10: 224. 

62 Grabau DA, Nielsen O, Hansen S, Nielsen MM, Lænkholm 

A-V, Knoop A, Pfeiffer P. (1998). Influence of 

storage temperature and high-temperature antigen 

retrieval buffers on results of immunohistochemical 

staining in sec-tion stored for long periods. Applied 


63 Miller RT, Kubier P. (1997). Blocking of endogenous 

avidin-binding activity in immunohistochemistry. The 

use of egg whites. Applied Immunohistochemistry 5: 

63. 

64 Vyberg M, Nielsen S. (1998). Dextran polymer conjugate 

two-step visualization system for immunohistochemistry. 

A comparison of EnVision+ with two threestep 

avidin-biotin techniques. Applied 


65 Sabattini E, Bisgaard K, Ascani S, Poggi S, Piccioli M, 

Ceccarelli C, Pieri F, Fraternali-Orcioni G, Pileri SA. 

(1998). The EnVision+ system: A new immunohistochemical 

method for diagnostics and research. Critical 

comparison with APAAP, ChemMate, CSA, LABC, and 

SABC techniques. Journal of Clinical Pathology 51: 

506. 

66 Erber WN, Willis JI, Hoffman GJ. (1997). An enhanced 

immunocytochemical method for staining bone marrow 

trephine sections. Journal of Clinical Pathology 

50: 389. 

67 von Wasielewski R, Mengel M, Gignac S, Wilkens L, 

Werner M, Georgii A. (1997). Tyramine amplification 

technique in routine immunohistochemistry. The 

Journal of Histochemistry & Cytochemistry 45: 1455. 

68 Brassil KE (1997). Antigen retrieval in immunohistochemistry 

- a new method using a domestic micro-


wave pressure cooker. Australian Journal of Medical 

Science 18: 84. 

69 Taylor CR, Shi S-R, Chen C, Young L, Yang C, Cote 

RJ. (1996). Comparative study of antigen retrieval 

heating methods: Microwave, microwave and pressure 

cooker, autoclave and steamer. Biotechnic & Histochemistry 

71: 263. 

70 Shi S-R, Cote RJ, Chaiwun B, Young LL, Shi Y, Hawes 

D, Chen T, Taylor CR. (1998). Standardization of immunohistochemistry 

based on antigen retrieval technique 

for routine formalin-fixed tissue sections. Applied 


71 Morgan JM, Navabi H, Jasani B. (1997). Role of calcium 

chelation in high-temperature antigen retrieval 

at different pH values. Journal of Pathology 182: 233. 

72 Pileri SA, Roncador G, Ceccarelli C, Piccioli M, 

Briskomatis A, Sabattini E, Ascani S, Santini D, 

Piccaluga PP, Leone O, Damiani S, Ercolessi C, Sandri 

F, Pieri F, Leoncini L, Falini B. (1997). Antigen retrieval 

techniques in immunohistochemistry: Comparison 

of different methods. Journal of Pathology 

183: 116. 

73 Shi S-R, Cote RJ, Taylor CR. (1997). Antigen retrieval 

immunohistochemistry: Past, present and future. The 

Journal of Histochemistry & Cytochemistry 45: 327. 

74 Leong ASY, Milios J. (1996). Epitop retrieval with 

microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA 

with three commercial retrieval solutions Applied Immunohistochemistry 

4: 201. 

75 Vyberg M (2000) Personlig meddelelse. 

76 Taylor CR, Shi S-R, Cote RJ. (1996). Antigen retrieval 

for immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry 

4: 144. 

77 Koopal SA, Iglesias Coma M, Tiebosch ATMG, 

Suurmeijer AJH. (1998). Low-temperature heating 

overnight in Tris-HCl buffer pH 9 is a good alternative 

for antigen retrieval in formalin-fixed paraffinembedded 

tissue. Applied Immunohistochemistry 6: 

228. 

78 Shi S-R, Guo J, Cote RJ, Young LL, Hawes D, Shi Y, 

Thu S, Taylor CR. (1999). Sensitivity and detection 

efficiency of a novel two-step detectionssystem 

(PowerVision). for immunohistochemistry. Applied 

Immunohistochemistry & Molecular Morphology 7: 

244. 

79 Wester K, Wahlund E, Sundström C, Ranefall P, 

Bengtson E, Russell PJ, Ow KT, Malmström PU, Busch 

C (2000). Paraffin section storage and Immunohistochemistry. 

Applied Immunohistochemistry & Molecular 

Morphology 8: 61. 

80 Olapade-Olaopa EO, Ogunbiyi JO, MacKay EH, 

Muronda CA, Alonge TO, Danso AP, Shittu OB, Terry 

TR, Wong AJ, Habib FK. (2001). Further characterization 

of storage-related alterations in immunoreactivity 

of archival tissue sections. Applied Immunohistochemistry 

& Molecular Morphology 9: 261. 

81 Van der Broeck LJCM, Van der Vijver MJ. (2000). 

Assessement of problems in diagnostic and research 

immunohistochemistry associated with epitope instability 

in stored paraffin sections. Applied Immunohistochemistry 


82 Edgerton ME, Roberts SA, Montone KT. (2000). Immunohistochemical 

performance of antibodies on previously 

frozen tissue. Applied Immunohistochemistry 


83 Kämmerer U, Kapp M, Gassel AM, Richter T, Tank C, 

Dietl J, Ruck P. (2001). A new rapid immunohistochemical 

staining technique using the EnVision antibody 

complex. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 

49:623. 

84 Boenisch T. (1999). Diluent buffer ions and pH: Their 

influence on the performance of monoclonal antibodies 

in immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry 


85 Boenisch T. (2001). Formalin-fixed and heat-retrieved 

tissue antigens: A comparison of their immunoreactivity 

in experimental antibody diluents. Applied Immunohistochemistry 


86 Leong AS-Y, Lee ES, Yin H, Kear M, Haffajee Z, Pepperall 

D. (2002). Superheating antigen retrieval. Applied 

Immunohistochemistry & Molecular Morphology 

10: 263. 

87 Marzo AMD, Fedor HH, Gage WR, Rubin MA. (2002). 

Inadequate formalin fixation decreases reliability of 

p27Kip1 immunochemical staining: Probing optimal 

fixation time using high-density tissue microarrays. 

Human Pathology 33:756. 

88 Shi S-R, Cote RJ, Liu C, Yu MC, Castelao JE, Ross RK, 

Taylor CR. (2002). A modified reduced-temperature 

antigen retrieval protocol effective for use with a 

polyclonal antibody to Cyclooxygenase-2 (PG 27). 

Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 

10: 368. 

89 Nielsen S (2002). Personlig meddelelse. 

90 Petrosyan K, Tamayo R, Joseph D. (2002). Sensitivity 

of a novel biotin-free detection reagent (PowerVision+). 

for immunohistochemistry. Journal of Histotechnology 

25:247. 

91 Skacel M, Skilton B, Pettay JD, Tubbs RR. (2002). 

Tissue microarrays: A powerful tool for highthroughput 

analysis of clinical specimens: A review of 

the method with validation data. Applied Immunohistochemistry 

& Molecular Morphology 10:1. 

92 Nielsen L, Jensen J. (2003). Endogen peroxidase? – 

Metastase?: KL1 på Sentinel Node frysesnit. Erfaringer 

fra Vejle Sygehus. Poster ved “Histologisk årsmøde” 

for bioanalytikere. 

 

Mogens Vyberg 2005

2. Immunhistokemisk teknik - NordiQC

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?