ЛЕСНЫЕ И ПОЛЕВЫЕ МЫШИ Молекулярно-генетические ...

ГЛАВА 2гибридизация. Молекулярные топологии часто базируются наданных стохастических (селективно нейтральных) сегментовДНК, вероятнее всего, не вовлеченных в адаптацию вида. Этаадаптивная нейтральность является причиной, по которой данныесегменты ДНК полезны для построения эволюционных древ: ихмутации кумулятивны, монотонны и подобны часам. Наиболеечасто в качестве молекулярных маркеров в филогенетических исследованияхживотных используют гены мтДНК и члены мультигенногосемейства повторяющейся ядерной рибосомной ДНК(рДНК). В последнее время стали использовать белок-кодирующиегены и интроны яДНК.Секвенирование последовательностей ДНК (определение порядкануклеотидов в молекуле ДНК) — исчерпывающий методанализа ядерного и цитоплазматического геномов. В 80-х годахпрошлого столетия были разработаны два основных метода определенияпоследовательности нуклеотидов в клонированных фрагментахДНК. Один из них предложили А. Максам и У. Гилберт,другой — Ф. Сенгер (рис. 20). Эти работы ознаменовали новуюэру в истории молекулярной генетики. За разработку методов секвенирования,клонирования и встраивания генов инсулина человекав бактериальную клетку У. Гилберт и Ф. Сенгер в 1980 г.были удостоены Нобелевской премии. Согласно первому (химическому)методу в однонитиевой ДНК избирательно делаютсяразрывы, 5'-концы метятся радиоактивным фосфором, после чеготгроводятся электрофорез в полиакриламидных гелях и радиоактивнаяидентификация фрагментов. Второй (ферментативный)метод используется чаще. Для каждого эксперимента ставят четыререакции (отличающиеся присутствием того или иного модифицированногооснования) с однонитиевой ДНК и прикрепленнымк ней праймером. Достраивание цепи ДНК происходит домомента встраивания модифицированного основания, поэтомусреди продуктов реакции будет множество фрагментов различнойдлины. Фрагменты разделяют в полиакриламидных гелях, и последовательностилегко определяются. Возможность секвенированияв серийных лабораторных анализах появилась с разработкойновых технологий, позволяющих анализировать любые пробы,т. е. амплифицированные клонированием или с помощью PCRфрагменты ДНК, молекулярной массой выше 1000 пн (размергена эукариотического генома равен в среднем 1500 пн) на авто-90