ЛЕСНЫЕ И ПОЛЕВЫЕ МЫШИ Молекулярно-генетические ...

ГЛАВА 3сток генома, была изобретена К. Мюллисом (Mullis) в 1983 г., зачто через 10 лет он был награжден Нобелевской премией. Широкуюизвестность и применение метод получил после открытаятермостабильной (Taq) ДНК-полимеразы (Saiki et al., 1988). PCRпозволяет амплифицировать одиночные локусы ДНК в миллионыраз и получать последовательность длиной в несколько сотен пароснований. Существуют различные модификации метода, один изнаиболее часто используемых — RAPD-анализ случайно амплифицированнойполиморфной ДНК, как правило, некодирующей(Williams et al., 1990). Большинство полимераз распознают однонитиевуюДНК как подходящую матрицу и связываются с ней вточке, соседствующей с двуцепочечной нитью. ДНК-полимеразаоднонаправлена: новая ДНК синтезируется по направлению от5'- к 3'-концу (рис. 40). В идеальных условиях Taq-полимеразаможет синтезировать тысячи пар оснований в минуту. Обычно30 с достаточно для синтеза продуктов с молекулярной массой до500 пн, 60 с — для 500—1500 пн и 90 с — для более высокомолекулярныхампликонов (хотя в этом случае повышается возможностьпоявления артефактов). В каждом конкретном случае необходимаоптимизация условий реакции, хотя есть и некоторые общие положения,помогающие минимизировать альтернативные продуктыреакции (Palumbi, 1997).Обычно амплифицируется небольшое число фрагментов (5—10), а длина ампликона не превышает 3—4 тпн. НедостаткиRAPD: трудности разграничения полиморфизма и артефактов,отсутствие продуктов PCR при геномных отличиях, появлениеновых полос, сложность либо невозможность идентификациигомологичных локусов, что создает определенные препятствия егоиспользования в межпопуляционных и межвидовых сравнениях(Palumbi, 1997). Основные преимущества метода заключаются ввозможности работать с анонимными геномами, в использованиималого количества ДНК, в эффективности и относительно низкойсебестоимости (Hadrys et al., 1992). Любой продукт PCR можетбыть элюирован из геля, помечен радиоактивной или флуоресцирующейметкой и использован в качестве молекулярнго зонда вдальнейших экспериментах. Случайно/произвольно амплифицированнаяДНК (RAPD) может быть использована в молекулярнойэкологии для установления экологической идентичности анализируемыхформ, для исследования близкородственных связей,156